NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit

DNA断片化 (約1時間)

1. DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。
2. Covaris S2で断片化する。

• 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。
• DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。

Covarisの設定

DNAの長さ(目標)	350bp	550 bp
Duty Cycle	10%
Intensity	5	2
Cycles per Burst	200
Time (duration)	45
Mode	Frequency sweeping

1. DNA溶液 50 µl を回収する。

DNA精製

1. KAPA Hyper Pure Beads を80 µl加える。よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を捨てる。
3. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
5. 53 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
6. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清 50 µl を回収する。

末端整形 (約1.1時間)

1. 7 µl NEBNext UltraII End Prep Reaction Buf.と3 µl Enzyme Mixを加える(Enzyme Mixは粘性が高いのでピペットの目盛りは2µlにする)。10回ピペッティングで混ぜる。
2. 20℃で30分間、インキュベートする。
3. 65℃で30分間、インキュベートする。

アダプターのライゲーション (約1時間)

1. 2.5 µl アダプター原液を加える。最初のDNAが100ng以下の場合は希釈する(マニュアル参照)。
2. 30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。
3. 1 µl NEBNext Ligation Enhancerを加える。
4. 10回ピペッティングで混ぜる。
5. 20℃で15分間、インキュベートする。
6. 3 µl USER Enzymeを加える(ピペットの目盛りは2.5µl)。10回ピペッティングで混ぜる。
7. 37℃で15分間、インキュベートする。

サイズ分画 (約0.5時間)

1. 25 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
3. 10 µl AMPureXPを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
4. 遠心して上清を捨てる。
5. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
6. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
7. 17 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
8. 上清 15 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。

PCR (約1.5時間)

1. 5 µl Universal PCR primer、5 µl Index primer、25 µl NEBNext Ultra II Q5 Master Mixを加える。全体で50 µlになる。
2. 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 6 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
3. 45 µl AMPureXPを加え、を加え、精製する。32.5 µl 0.1 x TEを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。