BigDye Terminaterを使ったシークエンス

BigDye Terminaterを使ったシークエンス　

試薬

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• BigDye Terminator V3.1 Ready Reaction mix

• BigDye Terminator V3.1 5×Sequencing Buffer

• プライマー (0.8μM)

• 125mM EDTA

• 100%エタノール　

• 70%エタノール

• HiDi ホルムアミド

実験方法

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1. 試薬5種(BigDye、BigDye用buffer、プライマー、RNA産物、脱イオン水)を8連チューブに入れて、混ぜる
2. PCR反応させる

   96℃　10秒

   50℃　5秒

   60℃　1分

   25サイクル

   12℃　∞

3. エッペン管にPCR産物、3M NaOAc、100%エタノールを加え、Maxrpmで20分遠心
4. 室温で20分放置
5. 70%エタノールを加え、Maxrpmで5分遠心
6. エタノールを抜いて、2分乾燥
7. HiDiホルムアシドを加え、heatshock 95℃、2分
8. 氷で冷やし、ボルテックスと遠心
9. シークエンス用の容器に全量入れる

シークエンス

• • バッファーと蒸留水の交換は10日で必要なので、予めシーケンサーの使用簿を確認すること**
  • 空気抜きを忘れないこと**