BigDye Terminaterを使ったシークエンス
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BigDye Terminaterを使ったシークエンス
目次 |
試薬
- BigDye Terminator V3.1 Ready Reaction mix
- BigDye Terminator V3.1 5×Sequencing Buffer
- プライマー (0.8μM)
- 125mM EDTA
- 100%エタノール
- 70%エタノール
- HiDi ホルムアミド
Template Quantity for 20μl reaction
| DNA template | Quantity |
| PCR Product: | |
| ・100-200 bp | 1-3ng |
| ・200-500 bp | 3-10ng |
| ・500-1000 bp | 5-20ng |
| ・1000-2000 bp | 10-40ng |
| ・>2000 bp | 20-50ng |
| Single-stranded DNA | 25-50ng |
| Double-stranded DNA | 150-300ng |
Sequencing Reaction
反応液の組成
| 1サンプル | |
| BigDye Ready Reaction Premix | 1 µl |
| BigDye sequencing Buffer | 1.5 µl |
| プライマー(0.8μM) | 終濃度0.16 µM |
| Template | Template Quantity参照 |
| 滅菌水 | up to 10 µl |
| 合計 | 10 µl |
反応
- 試薬5種(BigDye、BigDye用buffer、プライマー、RNA産物、脱イオン水)を8連チューブに入れて、混ぜる
- PCR反応させる
- 96℃ 10秒
- 50℃ 5秒
- 60℃ 1分
- 25サイクル
- 12℃ ∞
- エッペン管にPCR産物、3M NaOAc、100%エタノールを加え、Maxrpmで20分遠心
- 室温で20分放置
- 70%エタノールを加え、Maxrpmで5分遠心
- エタノールを抜いて、2分乾燥
- HiDiホルムアシドを加え、heatshock 95℃、2分
- 氷で冷やし、ボルテックスと遠心
- シークエンス用の容器に全量入れる
シークエンス
- バッファーと蒸留水の交換は10日で必要なので、予めシーケンサーの使用簿を確認すること**
- 空気抜きを忘れないこと**
