BigDye Terminaterを使ったシークエンス
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BigDye Terminaterを使ったシークエンス
目次 |
試薬
- BigDye Terminator V3.1 Ready Reaction mix
- BigDye Terminator V3.1 5×Sequencing Buffer
- プライマー (0.8μM)
- 125mM EDTA
- 100%エタノール
- 70%エタノール
- HiDi ホルムアミド
Template Quantity for 20μl reaction
| DNA template | Quantity |
| PCR Product: | |
| ・100-200 bp | 1-3ng |
| ・200-500 bp | 3-10ng |
| ・500-1000 bp | 5-20ng |
| ・1000-2000 bp | 10-40ng |
| ・>2000 bp | 20-50ng |
| Single-stranded DNA | 25-50ng |
| Double-stranded DNA | 150-300ng |
Sequencing Reaction
反応液の組成
| 1サンプル | |
| BigDye Ready Reaction Premix | 1 µl |
| BigDye sequencing Buffer | 1.5 µl |
| プライマー(0.8μM) | 終濃度0.16 µM |
| Template | Template Quantity参照 |
| 滅菌水 | up to 10 µl |
| 合計 | 10 µl |
反応
- 96℃ 1分
- 96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 2分、のサイクルを25回
- 4℃ ∞
精製：エタノール沈殿
- マイクロチューブに
PCR産物 10μl
125mM EDTA 2.5μl
100%エタノール 30μl を加える - -20℃で20分静置
- 15000rpmで15分遠心 4℃
- アスピレーターで上清を除く
- 70%エタノールを 30μl加える
- 15000rpmで5分遠心 4℃
- アスピレーターで上清を除く
- Micro-Vac(遠心濃縮機)で1分乾燥 50℃
- HiDiホルムアミド 10μlを加え Vortexsし、サンプルを溶解する
（この状態で冷蔵なら1週間、冷凍なら1ヶまで遮光保存可能） - ヒートブロックで 95℃、2分
- すぐに on ice 5分
- 遠心して on ice
- シークエンス用96wellプレートに全量入れる
シークエンス
- 予め、シーケンサー(32号館)の予約をしておく
- 蒸留水は毎回交換する
- ウォータートラップ洗浄は1週間、バッファー交換は10日で必要のため、予め使用簿を確認する
- シークエンスは4サンプルで1RUN、FastSeqで約1時間かかる
- RUN終了後、データ保存に15分程度かかる
