NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit

ポリA精製

1. 10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする
2. NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。
3. RNA Binding Buffer (2x) 100 µl x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
4. RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。
5. 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。
6. 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
7. ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
8. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
9. Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
10. Tris Buffer 50µlを加え、懸濁する。
11. 80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
12. RNA Binding Buffer (2x) 50µlを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で5分間温める。
13. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
14. Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
15. First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。試薬はピンクの印
16. 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。
17. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。

cDNA合成

1. NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix 2 µl、水 8 µlを加える。試薬はピンクの印
2. 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
3. NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。試薬はオレンジの印
4. 16℃で1時間保温する。

DNA精製

1. AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
3. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
5. 50.5 µl RSB (TruSeqのキットに付属)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。
6. 上清 50 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。

末端形成

1. NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer (10x) 7 µl、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。試薬は緑の印
2. 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。

アダプター結合

1. NEBNext AdaptorをAdapter Dilution Bufferで5倍に希釈する。最初のRNAが250ng未満のときはさらに5倍希釈する。100ng未満のときはさらに4倍希釈する。
2. 希釈したAdaptor 2.5 µl、NEBNext Ligation Enhancer 1 µl、NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30 µlを加える。試薬は赤の印
3. 20℃で15分間保温する。
4. USER Enzyme 3 µlを加える。
5. 37℃で15分間保温する。
6. AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。16 µl RSBを加え、15 µl 回収する。

PCR (約1.5時間)

1. Index Primer 2.5 µl、Universal PCR Primer 2.5 µl 、NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix 25 µlを加える。
2. 95℃で3分、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
3. AMPure XP 45 µl (0.9倍量)を加え、精製する。23 µl RSBを加え、21 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。