RAD-Seqのライブラリ作成

アダプターの作成

Illumina Read2

Illumina Read2(50μM) 5µl
T4 Polynucleotide Kinase 0.5μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl
H2O 12μl

を混ぜる。

1. 37℃で30分間保温する。
2. 65℃で20分間保温する。

Illumina Read2_RT(50μM) 5μl
10x Buffer H 3μl
H2O 2μl

を加える。

1. 95℃で5分間保温する。
2. ヒートブロックの電源をoffにする。
3. 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
4. エタノール沈殿をする。
5. H₂O 10μlに溶かす。

RAD Seq

RAD Seq F(50μM) 5μl
RAD Seq R(50μM) 5μl
10x Buffer H 3μl
H2O 17μl

を混ぜる。

1. 95℃で5分間保温する。
2. ヒートブロックの電源をoffにする。
3. 30℃になるまで、５分おきに温度を記録する。（１分あたり-1℃が目安）
4. エタノール沈殿をする。
5. H₂O 10μlに溶かす。

エタノール沈殿

サンプルの1/10量の3M NaOAc
サンプルの2.5倍量の100% EtOH

を加えて、混合する。

1. -20℃に20分間置く。
2. 4℃、15000rpm、15分間遠心。
3. アスピレーターで上清を廃棄する。
4. 半量の70%EtOHを加える。
5. 4℃、15000rpm、5分間遠心。
6. 上清を廃棄。
7. 遠心エバポレーターで2分間乾燥。

制限酵素切断

DNA 1μg
BamHⅠ 1μl
10x Buffer K 2µl
H2O
合計 20μl

を混ぜる。

1. 37℃で1時間保温する。
2. エタノール沈殿する。
3. H₂O 10μlに溶かす。

アダプター(RAD Seq)の結合

DNA 5μl
RAD Seq 10pmol
T4 DNA Ligase 0.5μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μl
H2O
合計 10μl

を混ぜる。

1. 20℃で1時間保温する。
2. 70℃で10分間保温する。
3. 異なるアダプターを加えたサンプルをまとめ、H₂Oを加えて50μlにする。
4. Covarisで超音波断片化する。
5. AMPureで精製する。

   • AMPure 80μl
   • RSB 44µl加え、42µl回収

6. End Prep Enzyme Mix 3µl、End Repair Reaction Buffer 5µlを加える。
7. 20℃で30分間保温する。
8. 65℃で30分間保温する。
9. エタノール沈殿する。
10. H₂O 12μlで溶かす。

アダプター(Illumina Read2)の結合

DNA 10µl
Illumina Read2 20pmol
T4 DNA Ligase 1μl
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 2μl
H2O
合計 20μl

を混ぜる。

1. 20℃で1時間保温する。
2. 70℃で10分間保温する。
3. RSB 30µlkを加える。
4. サイズ分画する。

   • RSB 22μl加え、20µl回収

PCR増幅

DNA 10µl
Universal Primer(10µM) 2.5µl
Index Primer(10µM) 2.5µl
PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5µl
5x Buffer 10µl
dNTP Mixture 4µl
H2O
合計 50µl

を混ぜる。

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98℃ 30秒

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98℃ 10秒

65℃ 1分15秒

x15

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65℃ 5分

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4℃ ∞

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でPCR反応を行う。

AMPureで精製する。

• AMPure 50µl
• RSB 32.5µl加え、30µl回収

AMPure精製

1. AMPure XPを加える。
2. よく混合して、室温で5分間静置する。
3. 10000rpm、5秒間遠心。
4. 磁性スタンドに立て、2分間静置。
5. 磁性スタンドに立てたまま、マイクロピペットで上清を廃棄する。
6. 70%EtOHを200μl添加する。
7. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
8. 70%EtOHを200μl添加する。
9. 室温で30秒間静置、上清を廃棄。
10. 10000rpm、5秒間遠心。
11. 磁性スタンドに立て、上清を廃棄。
12. 室温で5分間蓋を開けて乾燥させる。
13. Resuspension Buffer(RSB)を添加し、よく混合する。
14. 室温で2分間静置する。10000rpm、５秒間遠心。
15. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。

サイズ分画

AMPure XP 60µl
H2O 40µl

を混ぜ、AMPureを希釈する。

1. 希釈したAMPure 80µlを加え、よく混合する。
2. 室温で5分間静置して、遠心する。
3. 磁性スタンドに立て、上清を回収する。
4. AMPure 15µlを加えて、精製する。