LA Taqを使ったPCR

PCRの原理、手順など

PCRの原理、手順などの詳細は、[「MightyAmpを使ったPCR」]へのリンクのページを参照

※注意：LA Taqを使用したPCRの反応液の調製は、必ずon ice(氷の上)で行うこと

試薬

• MightyAmp (Takara)
  • MightyAmp DNAポリメラーゼは酵素なので、-20℃で保存し、冷凍庫から取り出すときにはアイスボックスにいれておく。
  • PCRに使用する酵素は耐熱性なので熱には強いが、強い攪拌(かくはん)により活性が落ちることがあるので、酵素を入れたあとはボルテックスなどはしない。
• 10 µM プライマーストック
  • 合成したオリゴDNAは100µMもしくは50µMの濃度で届くことが多い。そのままでは希釈率が大きくなり扱いにくいので10µM程度に希釈したものをストックとして作っておくのがよい。
  • プライマーは特定の鋳型となるDNAとセットで使用することが多い。このとき、あるサンプルのDNAがプライマーに混入すると、それ以後の実験では混入したDNAから増幅されてしまう事故が起きる。購入したオリゴDNAがコンタミすると、買い直す必要が生じる。これを避けるためにも、購入したオリゴDNAを直接実験に用いないほうがよい。

手順

1. 0.2mlチューブ、もしくは8連チューブ、もしくは96ウェルプレートに以下のように混ぜ合わせる。
   • プライマーは、"Sense"と"Anti-sense"の2つ入れることを忘れないように。

	50 µl スケールの場合	備考
LA Taq (TaKaRa)	0.5 µl
10x LA PCR Buffer ll (Mg2+ free)	5 µl
25mM MgCl2	5 µl	(最終濃度：2.5mM)
2.5mM dNTPs	8 µl
10 µM プライマー (Sense)	1.25 µl	(最終濃度：0.25µM)
10 µM プライマー (Anti-sense)	1.25 µl	(最終濃度：0.25µM)
鋳型DNA	1 µl	基本的に1µl。実験条件により変える
滅菌水	(up to 50 µl)	計50µlになるように、滅菌水を入れる
合計	50 µl

1. 蓋をしてサーマルサイクラーにいれる。
2. 94℃ 2分 → ( 94℃ 30秒、"アニーリング温度" 30秒、72℃ "1kbにつき1分" ) x40サイクル → 72℃ 7分 (→ 4℃ ∞)。

• "アニーリング温度"と"伸長反応の時間"はプライマー、サンプルによって異なるため、毎回確認して、ノートに記録しておくこと！