DNAの定量 (DS-11 FX+)
DNA定量の原理
DNAやRNAに含まれる塩基はその構造中に多数の二重結合がある。 二重結合は紫外線を吸収するので、吸光度を測定することで物質の濃度を測定することができる。
吸光度を用いた定量は簡便であるが、不純物の影響を受けやすいのが弱点である。 また感度はそれほど高くない。 希釈しない場合は5 ng/µl程度が限界である。
DNAとRNAは260 nmに極大吸収波長をもつ。 DNAの場合260 nmにおける吸光度と280 nmにおける吸光度の比(A260/A280)が1.8になる。 一方RNAの場合はA260/A280は2.0になる。 この数値をみてRNAやDNAのコンタミの程度を知ることもできる。
植物から抽出したDNAやRNAの場合、230 nmにおける吸光度が高くなることがある。 これは抽出物に含まれる不純物によるものである。
二本鎖DNAの濃度はA260の数値に50をかけて算出することが多い(単位は ng / µl)。 一本鎖DNA(オリゴDNAを含む)の濃度はA260の数値に35をかけて算出することが多い。 RNAの濃度はA260に40をかける。
装置
微量分光光度計 DeNovix社 DS-11 FX+ (＠2階 31号館 312A号室)
必要品
- サンプル
- BLANK用の水 (あるいは、TEなどのDNAを溶かした溶液)：エッペン等のチューブに入れて持参
- ピペットマン（P-20）、チップ
- プロワイプ
- USBメモリ
- IDカード（部屋の入室時に“登録済みの”IDカードが必要。教員等から借りる）
手順
[1] DNAの濃度が高い場合は適宜希釈する。
[2] 装置の電源を入れる。（電源スイッチ：装置の後ろ側）
[3] メニュー画面で、「dsDNA」を選択。 ※RNAの場合「RNA」を選択
[4] ＜ゼロ合わせ＞ アームを上げて、ステージにBLANK用の水を2µlのせる。アームを下ろして、「BLANK」を押す。終わったら、アームを上げてステージをプロワイプで拭く。
※使用前のステージの清掃も兼ねて、「BLANK」（ゼロ合わせ）は2回行うとよい。
[5] ＜ゼロ合わせの確認＞ ステージにBLANK用の水を2µlのせる。アームを下ろして、「Analyze」を押す。測定後に、アームを上げてステージをプロワイプで拭く。
※ゼロ合わせができているか確認する。値がずれていたら、「BLANK」からやり直す。
[6] ＜測定＞ [5] と同じ要領で、各サンプルの濃度を測定する。 ※毎回の測定後に、ステージをプロワイプで拭く
※各サンプルの濃度、波形を確認
[7] ＜データの取得＞ 「Report」タブを選択。測定結果の一覧が表示される。
- 保存したいサンプルのデータを選択。 ※左上の"田"を選ぶと全選択
- USBメモリを差し込む。 ※装置の後ろ側
- 右上の"∴"のようなアイコンを選択。保存先にUSBメモリを選択
- 適当なファイル名をつけて保存。 ※このファイルはPC上でエクセルで開ける
[8] 電源OFF。USBメモリを抜く
