RNAの定量 (invitrogen Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit)

このキットの原理、定量可能なRNAの濃度 等

• RNAに特異的な蛍光色素RiboGreenを使って定量する。
• この色素はDNAにも結合するので、混入DNAの影響も受けるため要注意ではあるが、吸光度(UV)より正確に微量のRNAでも定量できる。

• 定量するRNAの濃度によって、「High-range assay」「Low-range assay」の2通りの測定方法がある。
• 反応液に混ぜる蛍光色素の量が異なる。通常扱う濃度のRNAでは、「High-range assay」で行う

• RNA1µlを200µlの反応液で定量する場合（96穴プレートを使用）

	High-range assay	Low-range assay
定量可能なRNA濃度	4 ～ 200 ng/µl	0.2 ～ 10 ng/µl

　200 ng/µlを超える場合、RNAを希釈して定量する

試薬

• invitrogen社 Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit（4度保存）
  • Ribo Green
  • 20x TE　：　標品の希釈にはを希釈する
  • rRNA standard ： キットに5本(200µlずつ)添付。使用中の1本以外は-80℃で保存

手順

標品を準備する

1. 100 ng/µl λDNAを水または適当なバッファーで10倍に希釈して 10 ng/µl を作成する。20 µl程度あればよい。
2. 同様に10 ng/µl から 1 ng/µl を作成する。
3. 100, 10, 1 ng/µl それぞれを2倍に希釈して 50, 5, 0.5 ng/µl を作成する。それぞれ10 µl程度あればよい。

定量

1. 以下を混ぜる

	1サンプル	10サンプル
H2O	190µl	1.9 ml
20x TE	10µl	100 µl
200x Dye	0.5 µl	5 µl

1. 200µlずつ分注する。
2. 1µlサンプルを加える。よく混ぜる。
3. 蛍光を測定する。490nm 励起、510-570nm 蛍光。