RNAの定量 (invitrogen Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit)

このキットの原理、定量可能なRNAの濃度 等

• RNAに特異的な蛍光色素RiboGreenを使って定量する。
• この色素はDNAにも結合するので、混入DNAの影響も受けるため要注意ではあるが、吸光度(UV)より正確に微量のRNAでも定量できる。

• 定量するRNAの濃度によって、「High-range assay」「Low-range assay」の2通りの測定方法がある。
• 反応液に混ぜる蛍光色素の量が異なる。この研究室で通常扱うRNAの濃度範囲は、「High-range assay」に相当

• RNA1µlを200µlの反応液で定量する場合（96穴プレートを使用）

	High-range assay	Low-range assay
定量可能なRNA濃度	4 ～ 200 ng/µl	0.2 ～ 10 ng/µl

200 ng/µlを超える場合、RNAを希釈して定量する

試薬

• invitrogen社 Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit（4℃保存）
  • Ribo Green
  • 20x TE
  • rRNA standard (100ng/µl) ： キットに5本(200µlずつ)添付。使用中の1本以外は-80℃で保存

手順

標品を準備する

1. （20xTEを20倍に希釈して1xTEを作る　※この時の水はRNase free water）
2. rRNA standard (100ng/µl)を1xTEで5倍に希釈して 「20ng/µl」 を作製　（TE 18µl + rRNA 2µl）
3. 同様に、(20ng/µl)を1xTEで5倍に希釈して 「4ng/µl」 を作製

• 標品（検量線用）は、[200 (rRNA(100ng/µl)を2µl), 100, 20, 4 ng/µl] の4点

定量

1. 以下を混ぜる　{| class='wikitable'

|||1サンプル||10サンプル |- |H2O||190µl||1.9 ml |- |20x TE||10µl||100 µl |- |Ribo Green||0.5 µl||5 µl |}

1. 200µlずつ分注する。
2. 1µlサンプルを加える。よく混ぜる。
3. 蛍光を測定する。490nm 励起、510-570nm 蛍光。