In-Fusion Cloning

使用するキット

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• 「In-Fusion HD Cloning Kit」 (TaKaRa: Clontech) 　＠フリーザー（-20℃）

実験方法

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(1) PCR産物の前処理

• 下記の(a)(b)いずれかの方法でPCR産物の前処理を行う

(a) カラムでの精製 （ベクターを制限酵素処理した場合も同様）

　　　⇒ NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製 を参照

(b) Cloning Enhancer処理

• PCR後の電気泳動での確認時に、非特異的なバンドがなかった場合、この方法を用いることが可能

1. 以下の要領で、反応液を調製する。（計7µl）

	添加量
PCR産物	5 µl
Cloning Enhancer	2 µl

2. 「37℃で30分 → 80℃で20分」反応させる。

(1) In Fusion反応

• 下記の(a)(b)いずれかの方法でPCR産物の前処理を行う

(a) カラムでの精製 （ベクターを制限酵素処理した場合も同様）

　　　⇒ NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製 を参照

(2) 3'末端のdA付加反応

1. (1)で調製したPCR産物（9 µl）に「10x A-attachment Mix」1 µl を添加してよく混ぜる。

2. 60℃で10分間反応させる。 　　 ※30分まで延長可能

3. 次のライゲーションの直前まで、氷上（あるいは、4℃）に置く

• dA付加反応後は、すぐに次のライゲーションを行う　（この反応で形成した3'突出末端は不安定なため、ライゲーション前で放置しない）

(3) ライゲーション

1. 以下の要領で、ライゲーション反応液を調製する。（計10µl）

	添加量	備考
2x Ligation Buffer	5 µl	-20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと
pTA2 vector (50ng/µl, 3kb)	1 µl	-20℃から出して溶解したら、すぐに氷上に置くこと
(2)でdA付加したPCR産物	3 µl	(モル換算で)vectorの3倍以上の量になるとよい
T4 DNA Ligase	1 µl	氷上に置く（orクーラーボックスを使う）

2. 16℃で30分以上反応させる。

(4) 大腸菌DH5αの形質転換

あとは、ライゲーション産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する

• 選抜用の抗生物質は、アンピシリン（50mg/l）を使う
• インサートの有無をチェックできるように、大腸菌をプレートに撒く前に、X-Gal (2%)、IPTG (0.1M)をプレート1枚につき20μlずつ塗布する

• インサートが入ったコロニーは白色、インサートが入らなかったコロニーは青色になる （青白判定）