In-Fusion Cloning

使用するキット

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• 「In-Fusion HD Cloning Kit」 (TaKaRa: Clontech) 　＠フリーザー（-20℃）

実験方法

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(1) PCR産物の前処理

• 下記の(a)(b)いずれかの方法でPCR産物の前処理を行う

(a) カラムでの精製 （ベクターを制限酵素処理した場合も同様）

　　　⇒ NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製 を参照

(b) Cloning Enhancer処理

• PCR後の電気泳動での確認時に、非特異的なバンドがなかった場合、この方法を用いることが可能

1. 以下の要領で、反応液を調製する。（計7µl）

	添加量
PCR産物	5 µl
Cloning Enhancer	2 µl

2. 「37℃で30分 → 80℃で20分」反応させる。

(2) In-Fusion Cloning

1. 以下の要領で、反応液を調製する。（計5µl）

	添加量	備考
線状化ベクター	X µl	基本：2 µl。25-100ng分
インサートのPCR産物	Y µl	基本：2 µl。25-100ng分。※(1)でCloning Enhancer処理したものは、インサート・ベクター合わせて2 µlまで
dH2O	Z µl	Z = 4-(X+Y)
5x In-Fusion HD enzyme Premix	1 µl

2. 16℃で30分以上反応させる。

(4) 大腸菌DH5αの形質転換

あとは、ライゲーション産物を用いて大腸菌DH5αのコンピテントセルを形質転換する

• 選抜用の抗生物質は、アンピシリン（50mg/l）を使う
• インサートの有無をチェックできるように、大腸菌をプレートに撒く前に、X-Gal (2%)、IPTG (0.1M)をプレート1枚につき20μlずつ塗布する

• インサートが入ったコロニーは白色、インサートが入らなかったコロニーは青色になる （青白判定）