長いPCR産物のライブラリ作成

PCR産物の断片化

1. PCR産物約10 µg/50 µlをCovarisのチューブにいれる。
2. 以下の条件でCovaris S2で断片化する

Covarisの設定

DNAの長さ(目標)	350bp
Duty Cycle	10%
Intensity	5
Cycles per Burst	200
Time (duration)	45
Mode	Frequency sweeping

1. DNA溶液 46 µl を回収する。

1. 37℃で30分間保温する。
2. 65℃で20分間保温する。

PCR産物のリン酸化

1. 以下のように試薬を混ぜる

PCR 産物	8.5 µl
T4 Polynucleotide Kinase	0.5 µl
10x Buffer for T4 DNA Ligase	1µl	バッファーはDNA Ligaseのものを使用(ATPが入っている)

1. 37℃で30分間保温する。
2. 65℃で20分間保温する。

Loop Adapterを結合

1. 以下のように試薬を混ぜる

リン酸化PCR 産物	5 µl
1.5 µM Loop Adapter	0.5 µl
T4 DNA Ligase (NEB 2,000,000 unit/ml)	0.5 µl

1. 20 ℃で15分間保温する。
2. 70℃で10分間保温する。
3. 0.5 µl USERを添加する。
4. 37℃で15分間保温する。

AMPureで精製

1. よく懸濁したAMPure XPをDNAと等量加える。よく混ぜたあと、室温で5分間静置する。
2. 遠心してビーズを沈殿させたあと、磁性スタンドに立てて2分間静置する。
3. スタンドに立てたまま上清を除く。
4. 200µl 70% EtOHを加え、上清を除く。これを2回行う。
5. 遠心してビーズを沈殿させ、磁性スタンドに立てる。そこにたまったEtOHを除く。
6. 5分間蓋をあけたまま乾燥させる。
7. 27.5 µl RSAを加えて、懸濁する。2分間待つ。遠心後磁性スタンドに立て、25 µl 上清を回収する。
8. もう一度AMPureで精製する。25 µl 上清を回収する。

PCR増幅

1. 終濃度0.5µMになるようにUniversal PCR Primerと適当なIndex Primerを使って全量50µlでPCRを行う。
2. AMPure 50µlを加えてDNAを精製する。RSB 30µlでDNAを回収する。