ゲノム編集した植物のシークエンスの解析
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（注意：編集中！） CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。
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[1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合
- 以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html
アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ （概要説明） 1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する - pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる （＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる
- genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜 （制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する - pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる （＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する - 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析 - 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する
- PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う
[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて
- CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、PAM配列（NGG）の3塩基手前が切断される
- その切断個所を修復する際に、挿入・欠失 (indel)が生じて、フレームシフト等の変異型アリルが出現する
[3] 変異型アリルの検出（遺伝子型の同定：genotyping）
[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）
(1) 解析に使うファイルを準備する
- キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）
- ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマーでシークエンス解析したファイル
- ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）
