ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合

（注意：編集中！）　CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。

[編集] [1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合

アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う

(1) 解析に使うファイルを準備する

>U540k ATGGAAATCATGTCAAGAGAGAA..... >sgRNA3+PAM TGACAGAACCGGTATGGCCTGGG

（1行目）“>遺伝子名” を記入

（2行目）標的遺伝子のゲノムDNAの配列を記入
（3行目）“>sgRNA名など” を記入
（4行目）sgRNAの配列（PAM含めて）を記入

(2) シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を起動

自分のPCで解析したい場合
インストール方法：中部大学総合情報センターから「Genetyx」をダウンロード・インストールして使用する http://www.isc.chubu.ac.jp/services/chubu/genetyx.html 上記ページへのアクセス、および「Genetyx」のダウンロード・インストールは中部大学内のネットワークへの接続が必要
起動方法：「ATGC」は遺伝情報処理ソフトウェア「Genetyx」内にあるので、以下のいずれかの方法で起動する (A) 各自のPCの「C:ドライブ」-「Program Files」-「Genetyx_VerXX_Net」フォルダ内の「ATGC.exe」を起動 (B) 「Genetyx」を起動し、ツールバーの「起動」-「ATGC」を選択 (B)の方法で起動する場合は、ネットワーク認証が必要で、PCが中部大学内のネットワークに接続されている必要がある　（なので、(A)を推奨）
初期設定：「ATGC」は初回使用時にパラメータを設定する必要がある（共通PCは設定済み）「ファイル」-「環境設定」-「解析」を選択し最小ホモロジースコア「30」最小一致塩基数「10」に変更する

(3) 配列データをアセンブルして解析

1) 配列、およびシークエンス解析したファイルを取り込む（インポート）

「ファイル」-「新規」を選択し、(1)で用意したファイルを取り込む

2) 取り込んだ配列をアセンブルする

「解析」-「アセンブル」を選択し、さらに「アセンブル」を選択

「Contig」を展開（アセンブルした配列の表示）。
sgRNAを選択すると、その配列の先頭＝ゲノム編集箇所に移動。
波形ウィンドウを表示させる。
- 単一の波形が出現＝ホモ：そのまま配列を成形（→Aへ進む）
- 重なった波形が出現＝Bi-allelic（2個のアリル（変異）が混ざっている）：波形を分離して解析（→Bへ進む）