トマト葉からのDNA抽出方法

DNA抽出の原理

DNAの抽出はDNAが水に溶け、アルコールには溶けない性質を利用するものが多い。 Plant DNA Isolation Reagent (Takara社)はこの方法を植物からのDNA抽出用に特化している。

まず植物体を液体窒素で凍結して破砕する。 この操作により細胞が壊れ、DNAが抽出液に溶けるようになる。 液体窒素を使用する理由は主に二つあり、一つは低温に保つことで細胞の中にあるDNA分解酵素の働きを抑えることである。 もう一つは葉を凍結して固くすることで、乳棒・乳鉢ですり潰しやすくする。

植物のサンプルが粉末状になったらExtraction Solution 1(Sol1)を加える。 Sol1にはpHの緩衝作用があり、DNAが安定に溶解できるようにpHを8ぐらいに保つ。 またEDTAが含まれており、DNA分解酵素の働きに必要なMg2+ 適した試薬を調整している。

器具、試薬

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• トマトの葉
• 液体窒素
• Plant DNA Isolation Reagent

Extraction Solution 1

Extraction Solution 2

Extraction Solution 3

• イソプロパノール
• 70%エタノール
• TE溶液
• ヒートブロック
• 遠心機

実験方法

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手袋を着用して、実験を行う。

1. トマトの葉100mg程を量り、乳鉢に入れる。
   液体窒素を入れて、乳棒ですりつぶす。
2. Extraction Solution 1　400μlを加えて乳鉢の中でよく混ぜる。
3. Extraction Solution 2　80μlを加えて乳鉢の中でよく混ぜる。
4. マイクロチューブ(1.5ml)に移す。
5. Extraction Solution 3　150μlを加えてよく混ぜる(ボルテックスなど)。
6. ヒートブロック(50℃)に15分間置く。
7. 15000rpmで15min遠心し、上澄みを別のマイクロチューブにとる。
8. 上澄みに同量のイソプロパノールを加え、混合してDNAを沈殿させる。
9. 別のマイクロチューブに70%エタノールを1mlとり、DNAを入れる。
10. 15000rpmで5min遠心して、エタノールを除き、乾燥させる。
11. TE溶液100μlを加えて、4℃で保存する。