ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

（注意：編集中！）　

• CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異アリルを同定する方法についての解説

• ゲノム編集の概要・変異アリルの検出方法(genotyping)については、「 シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」を参照

[1] キャピラリーシーケンスを行い、 解析に使うデータ（ファイル）を準備する

※ 詳細は、「 シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定」の [4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）を参照

• キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）

• ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマー（センス、アンチセンス）でシークエンス解析したファイル

• ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報
• sgRNA配列の情報

[2] 「仮想実験室：Mitsucal」を用いてデータを解析する

• 「仮想実験室：Mitsucal」のツール「波形分離（重なった波形を分離する）」を用いて解析を行う。

1. 「仮想実験室：Mitsucal」のサイトへ移動　https://mitsucal.tsbio.info/vl/
   
2. "やること"のプルダウンから「重なった波形を分離する」を選択
   
3. "参照配列" に"遺伝子のもとの配列"をコピー＆ペーストし、波形ファイル（拡張子.ab1）を送信して、「Start」

• 「波形分離」ツールの使い方の解説は、鈴木研究室のホームページの記事を参照　http://biochemistry.isc.chubu.ac.jp/labo/suzuki/archives/812

これ以降は編集途中の産物

アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う

ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合