DNAの定量 (NanoVue)

DNA定量の原理

DNAやRNAに含まれる塩基はその構造中に多数の二重結合がある。 二重結合は紫外線を吸収するので、吸光度を測定することで物質の濃度を測定することができる。

吸光度を用いた定量は簡便であるが、不純物の影響を受けやすいのが弱点である。 また感度はそれほど高くない。 希釈しない場合は5 ng/µl程度が限界である。

DNAとRNAは260 nmに極大吸収波長をもつ。 DNAの場合260 nmにおける吸光度と280 nmにおける吸光度の比(A260/A280)が1.8になる。 一方RNAの場合はA260/A280は2.0になる。 この数値をみてRNAやDNAのコンタミの程度を知ることもできる。

植物から抽出したDNAやRNAの場合、230 nmにおける吸光度が高くなることがある。 これは抽出物に含まれる不純物によるものである。

二本鎖DNAの濃度はA260の数値に50をかけて算出することが多い(単位は ng / µl)。 一本鎖DNA(オリゴDNAを含む)の濃度はA260の数値に35をかけて算出することが多い。 RNAの濃度はA260に40をかける。

装置

GE社 NanoVue Plus

手順

1. DNAの濃度が高い場合は適宜希釈する。
2. 装置の電源を入れる。
3. スイッチを押す。
4. 自動で印字されるようにするには、を押す。
5. 水もしくはDNAを溶かすのに用いた溶液(TEなど)を十字の真ん中に2µlのせる。
6. レバーを下げ、補正を行う。
7. もう一度補正を行う。
8. サンプルを2µlのせて、レバーを下げる。

後片付け

全てのサンプルの定量が終わったら、ステージを水で湿らせたキムワイプでふく。 最後に乾燥したキムワイプでふいて、装置の電源を切る。