DNAの定量 (NanoVue)

DNA定量の原理

DNAやRNAに含まれる塩基はその構造中に多数の二重結合がある。 二重結合は紫外線を吸収するので、吸光度を測定することで物質の濃度を測定することができる。

吸光度を用いた定量は簡便であるが、不純物の影響を受けやすいのが弱点である。 また感度はそれほど高くない。 希釈しない場合は5 ng/µl程度が限界である。

DNAとRNAは260 nmに極大吸収波長をもつ。 DNAの場合260 nmにおける吸光度と280 nmにおける吸光度の比(A260/A280)が1.8になる。 一方RNAの場合はA260/A280は2.0になる。 この数値をみてRNAやDNAのコンタミの程度を知ることもできる。

植物から抽出したDNAやRNAの場合、230 nmにおける吸光度が高くなることがある。 これは抽出物に含まれる不純物によるものである。

二本鎖DNAの濃度はA260の数値に50をかけて算出することが多い(単位は ng / µl)。 一本鎖DNA(オリゴDNAを含む)の濃度はA260の数値に35をかけて算出することが多い。 RNAの濃度はA260に40をかける。

装置

GE社 NanoVue Plus

手順

1. DNAの濃度が高い場合は適宜希釈する。
2. 装置の電源を入れる。
3. メニューが表示されたら、1. ライフサイエンス、1. DNAの順にボタンを押す。(メニューについている数字と対応するボタンを押す)。
4. ステージに水(もしくはTEなどのDNAを溶かした溶液)を2µlのせる。レバーを下げると自動で更生される。
5. 「A second reference ...」と表示されたら、もう一度水をのせて、レバーを下げる。これ以降は自動でサンプルを測定する。
6. 矢印キーの間にあるボタンを押すとメニューが表示される。
   1. プリント(2)を押すと結果が印字される。
   2. グラフ(3)を押すとスペクトラムが表示される。
   3. オートプリント(9)を押すと測定のたびに自動で印刷される。
7. サンプルを1µl(慣れないうちは2µl)のせて、レバーを下げて測定する。
8. 測定後はステージをキムワイプでふく。

後片付け

全てのサンプルの定量が終わったら、電源ボタンを長押しして電源をきる。 ステージを水で湿らせたキムワイプでふき、最後に乾燥したキムワイプでふく。