NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit

（補足・修正）

最新版は、Redmineを参照 https://kiku3.tsbio.info/redmine/projects/niwadata/wiki/NEBNext_Ultra_II_RNA_Library_Prep_Kit

• 当初のプロトコールの数か所を訂正・補足として追記（240116丹羽）
• 以下の記述のうち、「AMPure XP」は全て、「KAPA Hyper Pure Beads」に変更した。使用量は同じ。（220801以降）
• 以下の記述のうち、「RSB」は「0.1xTE」に変更した。（キットの付属品等を使う）（200603以降）
• ポリA精製の1～16（94℃で10分間保温まで）は"ロック付きチューブ"を使う
• 丹羽使用のプロトコールメモ(PDFファイル)は、このページに添付（丹羽ノートNo.2・76頁にさらに加筆したもの）

メディア:NEB-Next-UltraII-RNA_丹羽ノート_修正.pdf

ポリA精製

1. 10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする
2. NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。
3. RNA Binding Buffer (2x) 100 µl x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
4. RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。
5. 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。
6. 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
7. ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
8. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
9. Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
10. Tris Buffer 50µlを加え、懸濁する。
11. 80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
12. RNA Binding Buffer (2x) 50µlを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で5分間温める。
13. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
14. Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
15. First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。試薬はピンクの印
    1. * 訂正：「H2O 10 µl、First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µl」x (サンプル数分) のmixを作製し、そのうちの12µlを加える。
16. 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。
17. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。

cDNA合成

1. NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix 2 µl、水 8 µlを加える。試薬はピンクの印
2. 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
3. NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。試薬はオレンジの印
4. 16℃で1時間保温する。

DNA精製

1. AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
3. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
5. 50.5 µl RSB (TruSeqのキットに付属)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。
6. 上清 50 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。

末端形成

1. NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer (10x) 7 µl、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。試薬は緑の印
   1. * 補足：End Prep Enzyme Mix はキットの中で減りが速い、粘性が高いため、ピペットの目盛りを2 µlに合わせて吸う（と3 µl相当分が取れる）
2. 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。

アダプター結合

1. NEBNext AdaptorをAdapter Dilution Bufferで5倍に希釈する。最初のRNAが250ng未満のときはさらに5倍希釈する。100ng未満のときはさらに4倍希釈する。
2. 希釈したAdaptor 2.5 µl、NEBNext Ligation Enhancer 1 µl、NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30 µlを加える。試薬は赤の印
3. 20℃で15分間保温する。
4. USER Enzyme 3 µlを加える。
   1. * 補足：End Prep Enzyme Mix 同様に粘性が高いため、ピペットの目盛りを2.5 µlに合わせて吸う
5. 37℃で15分間保温する。
6. AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。16 µl RSBを加え、15 µl 回収する。
   1. * 訂正：AMPure XP は、87 µl (0.9x)

PCR (約1.5時間)

1. Index Primer 5 µl、Universal PCR Primer 5 µl 、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlを加える。
2. 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。RNAが100ngのときはサイクル数を12に、10ngのときは15にする。
3. AMPure XP 45 µl (0.9倍量)を加え、精製する。23 µl RSBを加え、21 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。