トマトSNPマーカーのライブラリ化
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2017年2月22日 (水) 11:44時点における157.110.120.101 (トーク)による版
目次 |
[編集] PCR産物のリン酸化
- 以下のように試薬を混ぜる
| PCR 産物 | 8.5 µl | |
| T4 Polynucleotide Kinase | 0.5 µl | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase | 1µl | バッファーはDNA Ligaseのものを使用(ATPが入っている) |
- 37℃で30分間保温する。
- 65℃で20分間保温する。
[編集] Loop Adapterを結合
- 以下のように試薬を混ぜる
| リン酸化PCR 産物 | 5 µl |
| 1.5 µM Loop Adapter | 0.5 µl |
| T4 DNA Ligase (NEB 2,000,000 unit/ml) | 0.5 µl |
- 20 ℃で15分間保温する。
- 70℃で10分間保温する。
- 0.5 µl USERを添加する。
- 37℃で15分間保温する。
[編集] AMPureで精製
- よく懸濁したAMPure XPをDNAと等量加える。よく混ぜたあと、室温で5分間静置する。
- 遠心してビーズを沈殿させたあと、磁性スタンドに立てて2分間静置する。
- スタンドに立てたまま上清を除く。
- 200µl 70% EtOHを加え、上清を除く。これを2回行う。
- 遠心してビーズを沈殿させ、磁性スタンドに立てる。そこにたまったEtOHを除く。
- 5分間蓋をあけたまま乾燥させる。
- 27.5 µl RSAを加えて、懸濁する。2分間待つ。遠心後磁性スタンドに立て、25 µl 上清を回収する。
- もう一度AMPureで精製する。25 µl 上清を回収する。
[編集] PCR増幅
- 終濃度0.5µMになるようにUniversal PCR Primerと適当なIndex Primerを使って全量50µlでPCRを行う。
- AMPure 50µlを加えてDNAを精製する。RSB 30µlでDNAを回収する。
