NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit

DNA断片化 (約1時間)

1. DNA 1 µg / 52.5 µl に調整する。
2. Covaris S2で断片化する。

- 古田(内線5548に電話する。装置の電源を入れておいてくれる)。 - DNA300bp micro Tube 130µl Holder XTUの設定を使用する。以下の設定は過去の記録で、現在の設定と同じかどうか不明。

Covarisの設定

DNAの長さ(目標)	350bp	550 bp
Duty Cycle	10%
Intensity	5	2
Cycles per Burst	200
Time (duration)	45
Mode	Frequency sweeping

1. DNA溶液 50 µl を回収する。

DNA精製

1. KAPA Hyper Pure Beads を80 µl加える。よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を捨てる。
3. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
5. 53 µl 0.1 x TEを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
6. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清 50 µl を回収する。

末端整形 (約1.1時間)

1. 7 µl NEBNext UltraII End Prep Reaction Buf.と3 µl Enzyme Mixを加える(Enzyme Mixは粘性が高いのでピペットの目盛りは2µlにする)。10回ピペッティングで混ぜる。
2. 20℃で30分間、インキュベートする。
3. 65℃で30分間、インキュベートする。

アダプターのライゲーション (約1時間)

1. 2.5 µl アダプター原液(最初のDNAが100ng以下の場合は、希釈する。マニュアル参照)を加える。
2. 1 µl NEBNext Ligation Enhancer、30 µl NEBNext Ultra II Ligation Master Mixを加える。
3. 10回ピペッティングで混ぜる。
4. 30℃で10分間、インキュベートする。
5. 5µl Stop Ligase Mixを加える。10回ピペッティングで混ぜる。
6. Sample Purification Beads (42.5 µl)を加え、精製する(上のDNA精製と同じ)。52.5 µl RSBを加え、50 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。
7. Sample Purification Beads (50 µl)を加え、もう一度精製する。27.5 µl RSBを加え、25 µl をPCR用のチューブへ回収する。

サイズ分画 (約0.5時間)

1. Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。
   1. DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl
   2. DNAの長さ550bpのとき、Sample Purification Beads 50 µl、水 50 µl
2. 希釈したSample Purification Beads 80 µl(標準プロトコール160µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
3. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
4. Sample Purification Beads 15 µl(標準プロトコール30µlの半分)を加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
5. 遠心して上清を捨てる。
6. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
7. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
8. 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
9. 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。

PCR (約1.5時間)

1. 5 µl PCR Primer Cocktailを加える。25 µl PCR Master Mixを加える。初めて使用するときはPCR Master Mixを200 µlずつ小分けする。
2. 95℃で3分、(98℃で20秒、60℃で15秒、72℃で30秒) x 8 cycle、72℃で5分、のPCRを行う。
3. Sample Purification Beads (50 µl)を加え、精製する。32.5 µl RSBを加え、30 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。