NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit Ver. 240630

10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする。ロック付きチューブを使う。
NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。
RNA Binding Buffer (2x) 100 µl x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。
懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。
65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
Tris Buffer 50µlを加え、懸濁する。
80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
RNA Binding Buffer (2x) 50µlを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で5分間温める。
遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
H₂O 10 µl、First Strand Synthesis Reaction Buffer 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを混合し、そのうちの11µlを加える。試薬はピンクの印
94℃で15分間保温する。氷につけて室温に戻す。
遠心後、磁性体スタンドに置き、上清10µlを新しいチューブに回収する。

NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix 2 µl、水 8 µlを加える。試薬はピンクの印
25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer 8 µl、NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。試薬はオレンジの印
16℃で1時間保温する。

NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer 7 µl、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。試薬は緑の印
1. * 補足：End Prep Enzyme Mix はキットの中で減りが速い、粘性が高いため、ピペットの目盛りを2 µlに合わせて吸う（と3 µl相当分が取れる）
20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。

NEBNext AdaptorをAdapter Dilution Bufferで5倍に希釈する。最初のRNAが250ng未満のときはさらに5倍希釈する。100ng未満のときはさらに4倍希釈する。
希釈したAdaptor 2.5 µl、NEBNext Ligation Enhancer 1 µl、NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30 µlを加える。試薬は赤の印
20℃で15分間保温する。
USER Enzyme 3 µlを加える。
1. * 補足：End Prep Enzyme Mix 同様に粘性が高いため、ピペットの目盛りを2.5 µlに合わせて吸う
37℃で15分間保温する。
KAPA Hyper Pure Beads 87 µl (0.9x)を加え、精製する。16 µl 0.1xTEを加え、15 µl 回収する。

Index Primer 5 µl、Universal PCR Primer 5 µl 、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlを加える。
98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。RNAが100ngのときはサイクル数を12に、10ngのときは15にする。
KAPA Hyper Pure Beads 45 µl (0.9x)を加え、精製する。23 µl 0.1xTEを加え、できるだけ多く回収する。

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