NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit

（補足・修正）

最新版は、Redmineを参照

https://kiku3.tsbio.info/redmine/projects/niwadata/wiki/NEBNext_Ultra_II_RNA_Library_Prep_Kit

• 当初のプロトコールの数か所を訂正・補足として追記（240116丹羽）
• 以下の記述のうち、「AMPure XP」は全て、「KAPA Hyper Pure Beads」に変更した。使用量は同じ。（220801以降）
• 以下の記述のうち、「RSB」は「0.1xTE」に変更した。（キットの付属品等を使う）（200603以降）
• ポリA精製の1～16（94℃で10分間保温まで）は"ロック付きチューブ"を使う

ポリA精製

1. RNAを10 ng - 1 µg / 50 µLになるように希釈し、ロック付きチューブに入れる。
2. NEBNext Oligo d(T)25 beads 20 µL x サンプル数をエッペンに分注する。
3. RNA Binding Buffer (2x) 100 µL x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
4. RNA Binding Buffer (2x) 50 µL x サンプル数を加え、懸濁する。
5. 懸濁したビーズ50 µLをRNAに加える。
6. 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
7. ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
8. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
9. Wash Buffer 200 µLを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
10. Tris Buffer 50 µLを加え、懸濁する。
11. 80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
12. RNA Binding Buffer (2x) 50 µLを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で5分間温める。
13. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
14. Wash Buffer 200 µLを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
15. H₂O 10 µL、First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µL、NEBNext Random Primers 2 µL (合計20 µL)を混合し、このうち11 µLを加える。
16. 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。
17. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清10 µLを新しいチューブに回収する。

cDNA合成

1. NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix 2 µL、水 8 µLを加える。試薬はピンクの印
2. 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
3. NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µL、NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µL、水 48 µLを加える。試薬はオレンジの印
4. 16℃で1時間保温する。

DNA精製

1. KAPA Hyper Pure Beads 144 µL (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
3. 200 µL 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
5. 26 µL 0.1 x TE (マニュアルの半量)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。
6. 上清 25 µL を回収する。ここで止められる(-20℃)。

末端形成

1. NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer (10x) 3.5 µL、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 1.5 µLを加える(マニュアルの半量)。試薬は緑の印
2. 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。

アダプター結合

1. NEBNext AdaptorをAdapter Dilution Bufferで5倍に希釈する。最初のRNAが250 ng未満のときはさらに5倍希釈する。100 ng未満のときはさらに4倍希釈する。
2. 希釈したAdaptor 1.25 µL、NEBNext Ligation Enhancer 0.5 µL、NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 15 µlを加える(マニュアルの半量、合計46.75 µL)。試薬は赤の印。複数サンプルの場合、まとめて混合して、チューブのふたの裏側に入れていくとよい。
3. 20℃で15分間保温する。
4. USER Enzyme 1.5 µLを加える(マニュアルの半量、合計48.25 µL)。
   1. * 補足：End Prep Enzyme Mix 同様に粘性が高いため、ピペットの目盛りを1 µLに合わせて吸う
5. 37℃で15分間保温する。
6. KAPA beads 44 µL (0.9倍量)を加え、精製する。13 µL 0.1 x TEを加え、12 µL 回収する(マニュアルの0.8倍量)。

PCR (約1.5時間)

1. Index Primer 5 µl、Universal PCR Primer 5 µl 、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlを加える。
2. 98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。RNAが100ngのときはサイクル数を12に、10ngのときは15にする。
3. AMPure XP 45 µl (0.9倍量)を加え、精製する。23 µl RSBを加え、21 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。