クローニング KOD Plus

PCR

反応液の組成

試薬	1サンプル分の量	備考
KOD Plus	1 µl
KOD Plus buffer	5 µl
2 mM dNTP	5 µl
25 mM MgSO4	3 µl
プライマー	1 µMの場合、15 µl	終濃度 0.3 µM
鋳型 DNA	1 µl
滅菌水	up to 50 µl
合計	50 µl

反応

1. 94℃ 2分
2. 98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 2分 (1 kbp / min) のサイクルを35回
3. 68℃ 7分
4. 4℃

In-Fusion

1. PCR産物 1 µL、ベクター (pDONRをattL1とattL2で増幅したもの) 1.5 µL、Cloning Enhancer 1 µL を混合する。
2. 37℃ 15分、次いで80℃ 15分保温する。
3. 反応液 1 µL、In-Fusion 1 µL、H₂O 3 µLを混合する。
4. 50℃ 15分保温する。

形質転換

1. DH5αを氷上で解凍する。
2. In-Fusion反応産物 1 µLを加えて 5分氷上で保温する。
3. 42℃で 45秒保温し、すぐ氷上に戻す。2分待つ。
4. SOCを 0.5 - 1 mL加え、37℃で 1h培養する。
5. 抗生物質入りの培地にプレーティングして、37℃ 1日暗所で培養する。