NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit

ポリA精製

1. 10 ng - 1 µgのRNAを50µlにする
2. NEBNext Oligo d(T)25 beads 20µl x サンプル数をエッペンに分注する。
3. RNA Binding Buffer (2x) 100 µl x サンプル数を加え、ビーズを洗う。遠心して、ビーズを沈殿させ、磁性体スタンドに置く。上清を捨てビーズを回収する。2回行う。
4. RNA Binding Buffer (2x) 50 µl x サンプル数を加え、懸濁する。
5. 懸濁したビーズ50µlをRNAに加える。
6. 65℃で5分間保温する。その後氷につけて冷やす。
7. ビーズを懸濁しながら室温で5分間保温する。
8. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
9. Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。2回行う。
10. Tris Buffer 50µlを加え、懸濁する。
11. 80℃で2分保温する。その後氷につけて冷やす。
12. RNA Binding Buffer (2x) 50µlを加え、懸濁する。懸濁しながら室温で10分間温める。
13. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
14. Wash Buffer 200µlを加え、懸濁する。スタンドに置いて上清を捨てる。
15. 水 10 µl、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 8 µl、NEBNext Random Primers 2 µlを加える。試薬はピンクの印
16. 94℃で10分間保温する。氷につけて室温に戻す。
17. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を新しいチューブに回収する。

cDNA合成

1. Murine RNase Inhibitor 0.5 µl、ProtoScript II Reverse Transcriptase 1µl、水 3.5 µlを加える。試薬はピンクの印
2. 25℃で10分、42℃で15分、70℃で15分保温する。
3. Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10x) 8 µl、Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µl、水 48 µlを加える。試薬はオレンジの印
4. 16℃で1時間保温する。

DNA精製

1. AMPure XP 144 µl (1.8倍量)を加えて、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
2. 遠心後、磁性体スタンドに置き、上清を捨てる。
3. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
4. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
5. 60 µl RSB (TruSeqのキットに付属)を加え、懸濁する。2分室温で放置する。
6. 上清 55.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。

末端形成

1. NEBNext End Repair Reaction Buffer (10x) 6.5 µl、NEBNext End Prep Enzyme Mix 3 µlを加える。試薬は緑の印
2. 20℃で30分間、65℃で30分間、保温する。

アダプター結合

1. Blunt/TA Ligase Master Mix 15µl、1.5 µM NEBNext Adaptor 1 µl、水 2.5 µlを加える。試薬は赤の印 購入したNEBNext Adaptorは15µMの濃度なのでRSBで希釈する。
2. 20℃で15分間保温する。
3. USER Enzyme 3 µlを加える。
4. 37℃で15分間保温する。
5. AMPure XP 100 µl (等量)を加え、精製する。52 µl RSBを加え、50 µl 回収する。
6. AMPure XP 50 µl (等量)を加え、2回目の精製をする。22 µl RSBを加え、20 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。

PCR (約1.5時間)

1. Index Primer 2.5 µl、Universal PCR Primer 2.5 µl 、NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix 25 µlを加える。
2. 95℃で3分、(98℃で10秒、65℃で75秒) x 8 cycle、65℃で5分、のPCRを行う。
3. AMPure XP 45 µl (0.9倍量)を加え、精製する。23 µl RSBを加え、21 µl 回収する。ここで止められる(-20℃)。