アグロバクテリウムの形質転換

試薬

• gentamicin 50mg/ml
• rifanpicin 100mg/ml (DMSO溶液)
• 1mM HEPES-KOH pH 7.0 500ml
• 10% グリセロール

アグロバクテリムの株

|C58C1 pM90|100mg/l rifanpicin, 50mg/ml gentamicin|

コンピテントセルの作成手順

1. LB 5mlに適当な抗生物質を加え、形質転換するアグロバクテリウムを植菌する。30℃で30時間以上培養する。
2. LB 200ml に適当な抗生物質を加え、100μl植菌する。30℃で14時間培養する。
3. 6000rpm で5分間遠心し、沈殿を回収する。
4. 培養液と等量の1mM HEPES-KOHを加え、懸濁する。
5. 再び遠心し、沈殿を回収する。さらに2回HEPES-KOHで洗う。
6. 沈澱と等量の10% グリセロールを加え、懸濁する。
7. 50μlずつ分注し、-80℃で保存する。

形質転換

1. コンピテントセルを氷上で溶かす。
2. プラスミドDNAを加える。
3. 2mm幅のキュベットを用い、2500Vでエレクトロポレーションを行う。
4. 1ml SOCを加え、菌を回収する。
5. 30℃で2時間培養する。
6. 適当な抗生物質を含むLBプレートに50μlをプレーティングする。
7. 30℃で2日間培養する。

注意

• アグロバクテリウムに接触した実験器具は全てオートクレーブ処理する。