トマトSNPマーカーの解析

PCR

試薬

• MightyAmp (Takara)
  • MightyAmp DNAポリメラーゼは酵素なので、-20℃で保存し、冷凍庫から取り出すときにはアイスボックスにいれておく。
  • PCRに使用する酵素は耐熱性なので熱には強いが、強い攪拌(かくはん)により活性が落ちることがあるので、酵素を入れたあとはボルテックスなどはしない。
• 10 µM プライマーストック

手順

1. プライマーを 0.25 µM になるように混ぜ合わせる。10 µM のストックをそれぞれ1µlずつとり、合計40µlになるように水を加えるとよい。
2. 鋳型のDNAを100倍に希釈する。
3. 希釈したDNA、MightyAmpを以下のように混ぜ合わせて、PCRミックスとする。

	1サンプル分	48サンプル分	96サンプル分
DNA (100倍希釈)	0.8 µl|	40 µl	80 µl
MightyAmp	0.2 µl	10µl	20µl
2x Buffer	5 µl	250 µl	500 µl
合計	6 µl	6 µl x 50	6 µl x 100

1. PCR用の96ウェルプレートに6 µl ずつPCRミックスを分注する。
2. 0.25 µM プライマーを4µlずつ加える。このときピペッティングでよく混ぜる。
3. 耐熱シールでふたをする。隙間があると反応液が蒸発してしまうので念入りにシールを押し付ける。
4. 95℃ 3分(MightyAmpはHot Startなので必須)、98℃ 10秒 65℃ 15秒、68℃ 1分を40サイクルの条件でPCR反応を行う。