長いPCR産物のライブラリ作成

PCR産物の断片化

1. PCR産物約10 ng/50 µlをCovarisのチューブにいれる。
2. 以下の条件でCovaris S2で断片化する

Covarisの設定

DNAの長さ(目標)	350bp
Duty Cycle	10%
Intensity	5
Cycles per Burst	200
Time (duration)	45
Mode	Frequency sweeping

末端の修復 End Repair

NEBNext End Repair Module を使用

• 以下のように試薬を混ぜる

PCR 産物	44 µl
NEBNext End Repair Reaction Buffer	5 µl
NEBNext End Repair Enzyme Mix	1 µl

• 20℃で30分間保温する。

AMPureによる精製

1. Sample Purification Beadsと水を以下のように混ぜる。
   1. DNAの長さ350bpのとき、Sample Purification Beads 60 µl、水 40 µl
2. 希釈したSample Purification Beads 80 µlを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
3. 遠心後、磁性スタンドに立て、上清を回収する。
4. Sample Purification Beads 15 µlを加え、よく撹拌して、5分間室温で放置する。
5. 遠心して上清を捨てる。
6. 200 µl 80%エタノールを加え、30秒後、上清を捨てる。スタンドから外して混ぜたりする必要はない。2回行う。
7. 遠心して上清を捨てたあと、5分間乾燥させる。
8. 20 µl Resuspension Bufferを加え、懸濁する。2分室温で放置する。
9. 上清 17.5 µl を回収する。ここで止められる(-20℃)。