シロイヌナズナの遺伝子型の判定（2023年8月以前のver.）

試薬

• 0.4M NaOH
• 0.1M Tris-HCl pH 6.8

DNA抽出 　マルチビーズショッカー

1. 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
2. ビーズを一粒入れる
3. 40 µlの0.4M NaOHを入れる
4. 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
5. 遠心(フラッシュ)
6. 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
7. よく混合し、遠心(フラッシュ)
8. 上清を鋳型として用いる

PCR

反応液の組成

	1サンプル
ExTaq	0.1 µl
10×ExTaq Buffer	2 µl
2.5mM dNTP	1.6 µl
プライマー	終濃度0.2 µM
プライマー	終濃度0.2 µM
DNA	1 µl
滅菌水	up to 20 µl
合計	20 µl

反応

1. 95℃ 3分
2. [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
3. 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)

＜drol1変異体の判別方法＞

	判定する 遺伝子型	プライマーの組み合せ	アニーリング温度	伸長時間	PCR後の バンドの長さ	備考
[A]	drol1-1	・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII	55℃	1 min でOK	(185 bp)	このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別 　※方法は下記参照 HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp
[B]	drol1-2	・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3	55℃	2 min	「WT」 185 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp	プライマー3種類を混ぜて、「WT」「T-DNA = drol1-2」の判別を1回のPCRで判定 ※各々の増幅プライマーの組み合せ ・「WT」：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII ・「T-DNA = drol1-2」：At3g24730#143-F, LBb1.3
[C]	drol1-1, drol1-2 ※同時に判別する場合	・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3	55℃	2 min	「WT」「drol1-1」 185 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp	上記の[A][B]を組み合わせた検出方法 PCR後に制限酵素 Hind III で切って判別 HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp　 (drol1-2)≒355 bp
[D]	drol1-2 ※old ver. 上記推奨	「WT」 ・At3g24730#143-F ・anti6_At3724730 「T-DNA = drol1-2」 ・At3g24730#143-F ・LBb1.3	55℃	2 min	「WT」 371 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp	各個体について、「WT」「T-DNA = drol1-2」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 このプライマーでは、「WT」「T-DNA = drol1-2」のバンドの長さの差が小さいため、上記[B]のようなプライマー3種類を混ぜたPCRでは判別できない

＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞

	1サンプル
滅菌水	5.7 µl
10xM Buffer	1 µl
Hind III	0.3 µl
PCR産物（上記参照）	3 µl
合計	10 µl

→　37℃で1～2時間反応

MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別 　※Hind III処理後、(WT)185 bp 　(drol1-1)152 + 33 bp

＜各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位＞