塩基置換を導入する QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kis
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[編集] オリゴDNAを設計する
- Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) - (675/N) - % mismatch の式で、75℃以上に設計する。
- 長さは25-45nt。GC含量は40%、3'末端はGかCが望ましい。
- 複数のオリゴDNAを使用するときは、全て同じ鎖に結合するようにすること。
- ミスマッチはオリゴDNAの中央部に位置し、10-15ntがその両側に完全一致すること。
[編集] 変異導入
- プラスミドDNAを用意する。5kbpを超えるときはオリゴDNAの量などをマニュアルを参照して変更すること。
- オリゴDNAを希釈して100 ng/µlにする。オリゴDNAの長さを45塩基とすると 100 ng/µl = 100 / 45 / 330 * 1000 = 6.73 µMとなる。
- 10xQuickChange Multi reaction buffer 2.5 µl、オリゴDNA 1 µl (複数ある場合はそれぞれ1µl)、プラスミド 50 ng、dNTP mix 1 µl、QuickChange Multi enzyme blend 1 µl。水を加えて全量25 µlにする。
- 95℃で1分、(95℃で1分、55℃で1分、65℃で2分/kb) x 30 cycle、の反応を行う。プラスミドの大きさが4kbpのとき5時間程度かかる。
- DpnI 1 µlを加え、37℃で1時間保温する。
[編集] 形質転換
- XL10-Gold ultracompetent cellsを氷上で溶かす。1プラスミドごとに45 µlずつ分注する。
- β-ME 2 µlを加える。軽く混ぜる。2分ごとに混ぜながら10分間氷上で保温する。
- DpnIで処理したプラスミド 1.5 µlを加える。
- 30分間氷上で保温する。
- 42℃で30秒ヒートショックを与える。
- あらかじめ42℃に温めておいたSOCを0.5 ml加える。37℃で1時間振とうする。
- 適当な抗生物質の入ったLBプレートに撒く。一晩37℃で保温する。
