「シロイヌナズナの遺伝子型の判定」を編集中

__NOTOC__
== 試薬 ==
* 0.4M NaOH
* 0.1M Tris-HCl pH 6.8

== DNA抽出 　マルチビーズショッカー==
# 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
# ビーズを一粒入れる
# 40 µlの0.4M NaOHを入れる
# 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
# 遠心(フラッシュ)
# 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
# よく混合し、遠心(フラッシュ)
# 上清を鋳型として用いる

== PCR ==
=== 反応液の組成 ===
{| class='wikitable'
|||1サンプル
|-
|ExTaq||style="text-align:right;"|0.1 µl
|-
|10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"|2 µl
|-
|2.5mM dNTP||style="text-align:right;"|1.6 µl
|-
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
|-
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
|-
|DNA||style="text-align:right;"|1 µl
|-
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl
|-
|合計||style="text-align:right;"|20 µl
|}

=== 反応 ===
#  95℃ 3分
# [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
#  72℃ 5分  (→ 4℃ ∞)


==== ＜drol1変異体の判別方法＞ ====

{| class="wikitable"
|-
! 判定する遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! バンドの長さ !! 備考 
|-
| '''drol1-1''' ||  width="150pt" |・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || (185 bp) || このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別  　※方法は下記参照<br> HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp

|-
| '''drol1-2''' ||「genome,WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>371 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || 各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 <br>このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない

|-
| '''drol1-2''' <br>※未確認||・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>185 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || プライマー3本混ぜて、「genome,WT」「T-DNA」の判別を1回のPCRで判定 <br>・「genome,WT」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII <br>・「T-DNA」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, LBb1.3
|-
|}

==== ＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞ ====

{| class='wikitable'
|||1サンプル
|-
|滅菌水||style="text-align:right;"| 11.2 µl
|-
|10xM Buffer||style="text-align:right;"|1.5 µl
|-
|Hind III||style="text-align:right;"|0.3 µl
|-
|PCR産物（上記参照）||style="text-align:right;"|2 µl
|-
|合計||style="text-align:right;"|15 µl
|}→　37℃で1～2時間反応
<br> MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別
　※Hind III処理後、(WT)185 bp 　(drol1-1)152 + 33 bp