シロイヌナズナの遺伝子型の判定

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(1) DNA抽出 （マルチビーズショッカー）

試薬

• 0.4M NaOH
• 0.1M Tris-HCl pH 6.8

手順

1. 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
2. ビーズを一粒入れる
3. 40 µlの0.4M NaOHを入れる
4. 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
5. 遠心(フラッシュ)
6. 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
7. よく混合し、遠心(フラッシュ)
8. 上清を鋳型として用いる

(2) PCR

MightyAmp Ver.3 の場合 反応液の組成 試薬 1サンプル分の量 備考 MightyAmp Ver3 0.4 µl 2×MightyAmp buffer Ver3 10 µl プライマー (Forward) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl プライマー (Reverse) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl DNA 1 µl 滅菌水 up to 20 µl 合計 20 µl 反応 2step PCR 98℃ 2分 [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回 (→ 4℃ ∞) 3step PCR 98℃ 2分 [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回 (→ 4℃ ∞)

Ex Taq の場合 反応液の組成 試薬 1サンプル分の量 備考 ExTaq 0.1 µl 10×ExTaq Buffer 2 µl 2.5mM dNTP 1.6 µl プライマー (Forward) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl プライマー (Reverse) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl DNA 1 µl 滅菌水 up to 20 µl 合計 20 µl 反応 95℃ 3分 [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)

(3) 制限酵素処理

反応液の組成 1サンプル 滅菌水 5.7 µl 10x Buffer 1 µl 制限酵素 0.3 µl PCR産物（上記参照） 3 µl 合計 10 µl

反応 →　37℃で1～2時間反応

(4) 解析

MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別

＜ 各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位 ＞

WT (DROL1) PCR：プライマー(1)+(2)で増幅（185bp） HindIII処理後（185bpのまま） drol1-1 PCRプライマー：(1)+(2)で増幅（185bp） HindIII処理後（152+33bp） drol1-2 PCRプライマー：(1)+(3)で増幅（≒355bp） HindIII処理後（≒355bpのまま）

＜ drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー ＞

プライマーと制限酵素の組合せ

変異体	遺伝子名	PCRのプライマー	プライマー配列	PCR断片長	制限酵素	制限酵素処理後の長さ
drol1-1	DROL1	At3g24730#143-F drol1-1_dCAPS-HindIII	TGATATCACGTTGTTTCCTTCG GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT	185 bp	HindIII	(WT) 185 bp (drol1-1) 152+33 bp
drol1-2	DROL1	At3g24730#143-F drol1-1_dCAPS-HindIII LBb1.3	TGATATCACGTTGTTTCCTTCG GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT ATTTTGCCGATTTCGGAAC	(WT)185 bp (drol1-2)≒355 bp	-	-
sudl1-1 #8-5	U5-40k	m2g181F m2g181R	CAAGATACAATCACAGGTATGAGC CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC	383 bp	HaeIII	(WT) 272+111 bp (#8-5) 383 bp
sudl2-1 #47-1a	PRP6	prp6_47-1aF prp6_47-1aR	GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT	135 bp	HindIII	(WT) 135 bp (#47-1a) 102+33 bp
sudl2-2 #45-4b	PRP6	prp6_45-4bR prp6_45-4bF	GGAGATGGCTTGCCATTTCTCGCCATGCTTAAGCT GAACGTGCTGTTACCGTTGG	155 bp	HindIII	(WT) 155 bp (#45-4b) 120+35 bp
sudl3-1 #14-4	PRP8	prp8_14-4F prp8_14-4R	CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG	161 bp	PvuI	(WT) 128+33 bp (#14-4) 161 bp
sudl3-2 #49-4a	PRP8	prp8_49-4aF prp8_49-4aR	ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT	130 bp	SacI	(WT) 97+33 bp (#49-4a) 130 bp
sudl3-3 #51-2a	PRP8	prp8_51-2aF prp8_51-2aR	ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG	131 bp	DdeI	(WT) 97+34 bp (#51-2a) 131 bp
sudl4-1 #40-2b	SmBb	smbb_40-2bF smbb_40-2bR	GCTTCAGTTCATCAACTACAGG CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT	148 bp	HindIII	(WT) 148 bp (#40-2b) 113+35 bp
sudl4-2 #43-2b	SmBb	smbb_43-2bF smbb_43-2bR	TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG TCCACCAACACCACGAACAGGAC	133 bp	BamHI	(WT) 133 bp (#43-2b) 97+36 bp