シロイヌナズナの遺伝子型の判定
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| '''drol1-2''' ||「genome,WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>371 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || 各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 <br>このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない | | '''drol1-2''' ||「genome,WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>371 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || 各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 <br>このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない | ||
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2020年4月7日 (火) 13:58時点における版
試薬
- 0.4M NaOH
- 0.1M Tris-HCl pH 6.8
DNA抽出 マルチビーズショッカー
- 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
- ビーズを一粒入れる
- 40 µlの0.4M NaOHを入れる
- 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
- 遠心(フラッシュ)
- 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
- よく混合し、遠心(フラッシュ)
- 上清を鋳型として用いる
PCR
反応液の組成
| 1サンプル | |
| ExTaq | 0.1 µl |
| 10×ExTaq Buffer | 2 µl |
| 2.5mM dNTP | 1.6 µl |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| DNA | 1 µl |
| 滅菌水 | up to 20 µl |
| 合計 | 20 µl |
反応
- 95℃ 3分
- [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
- 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)
＜drol1変異体の判別方法＞
| 判定する遺伝子型 | プライマーの組み合せ | アニーリング温度 | 伸長時間 | バンドの長さ | 備考 |
|---|---|---|---|---|---|
| drol1-1 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII |
55℃ | 1 min でOK | (185 bp) | このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別 ※方法は下記参照 HindIII処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp |
| drol1-2 | 「genome,WT」 ・At3g24730#143-F ・anti6_At3724730 「T-DNA」 ・At3g24730#143-F ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「genome,WT」 371 bp 「T-DNA」 ≒355 bp |
各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない |
| drol1-2 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「genome,WT」 185 bp 「T-DNA」 ≒355 bp |
プライマー3本混ぜて、「WT」「T-DNA」の判別を1回のPCRで判定 「WT」（At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII）「T-DNA」（At3g24730#143-F, LBb1.3） |
＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞
| 1サンプル | |
| 滅菌水 | 11.2 µl |
| 10xM Buffer | 1.5 µl |
| Hind III | 0.3 µl |
| PCR産物（上記参照） | 2 µl |
| 合計 | 15 µl |
→ 37℃で1～2時間反応
MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別
※Hind III処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp
