ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

2021年11月10日 (水) 13:35時点における版

（注意：編集中！）　CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。

[1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合

• 以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの　　https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html

（※ ガイドRNAの設計方法については、別記参照)

アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う

[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて

• CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、PAM配列（NGG）の3塩基手前が切断される
• その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる

• 以下は、ゲノム編集での変異アリルの例

• 挿入・欠失 (indel) は上記の例のように、数bpの場合もあれば、数十bp～100bp以上の場合もある

[3] 変異型アリルの検出（遺伝子型の同定：genotyping）

• ゲノム変種による変異の有無を検出できるように、制限酵素サイトの近傍にsgRNAを設計する　（変異が生じると制限酵素サイトが無くなる）

• sgRNAの配列と検出に用いた制限酵素の例、については上記[2]の図を参照
• この例では、383bpのPCR産物をHaeIII処理すると、以下の長さの断片になる

・（野生型）制限酵素(HaeIII)で切れる　　->　272bp, 111bp の2本の断片

・（変異型）制限酵素(HaeIII)で切れない　->　約383bp の断片

• 遺伝子型の同定を行う際の「DNA抽出、PCR、制限酵素処理」の手順については、「シロイヌナズナの遺伝子型の判定」を参照

[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）

(1) キャピラリーシークエンスを行う

• [3]で用いたPCR産物（制限酵素処理"前"のもの）を用いて、シークエンス解析を行う
• キャピラリーシークエンスの方法は、「BigDye Terminaterを使ったシークエンス」を参照

• 1反応(計10ul)あたりに、PCR産物を "1ul" 使用する　

（プライマーダイマーがある場合は、精製・定量したうえで、プロトコール通りの量を使用　（精製方法：NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製）

• シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー

（PCR産物1個につき、両側のプライマー＝センス、アンチセンスの2種類で読むので、シークエンス＝2サンプル、となる）

(2) 解析に使うデータ（ファイル）を準備する

• キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）

• ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅したものを、両側のプライマーでシークエンス解析したファイル

• ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）

ゲノム編集した植物のシークエンスの解析：シーケンスアセンブリソフトウェア「ATGC」を使う場合