ゲノム編集した植物のシークエンスの解析

2021年11月10日 (水) 14:00時点における版

（注意：編集中！）　

CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。

以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの　　https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html

（※ ガイドRNAの設計方法については、別記参照)

アグロバクテリウムの感染後、シークエンス解析に至るまでの流れ　（概要説明）
1) 形質転換されたT1植物を選抜し、生育する pKIベクターを用いた場合、T1種子の中から「OLE-tagRFPが光る」ものを播いて育てる　（＝T-DNAが組み込まれている）
2) 目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜・生育し、T2種子をとる genotyping：PCR＋制限酵素処理で、変異遺伝子を持つ個体を選抜　（制限酵素処理で、切れる：野生型（WT型）、切れない：変異型）
3) T2世代で、Cas9を持たない植物を選抜する pKIベクターを用いた場合、T2種子の中から「OLE-tagRFPが光らない」ものを播いて育てる　（＝T-DNA、Cas9を持たない）
4) T2世代で、目的の遺伝子がゲノム編集されている個体を選抜する 2) と同様のgenotypingを実施
5) キャピラリーシークエンサーでの解析 4) のgenotypingの時のPCR産物（制限酵素処理する前のもの）を、キャピラリーシークエンサーで解析する PCRに用いた両端のプライマー各々で解析したファイルを作成。このファイルを用いて以降の解析を行う

・（野生型）制限酵素(HaeIII)で切れる　　->　272bp, 111bp の2本の断片

・（変異型）制限酵素(HaeIII)で切れない　->　約383bp の断片

(1) キャピラリーシークエンスを行う

＝PCR産物１個につき、シークエンスは２サンプル、となる　（両側のプライマー＝センス、アンチセンスの２種類で読むため

（プライマーダイマーがある場合は、精製・定量したうえで、プロトコール通りの量を使用　（精製方法：NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製）

(2) 解析に使うデータ（ファイル）を準備する

(3) シークエンスデータを解読して配列を決定し、アリルを同定する

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-'''（注意：編集中！）'''　CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。
+'''（注意：編集中！）'''
+* ゲノム編集した植物のシークエンス解析を行って、変異アリルを同定する方法について
+::* ゲノム編集の概要・変異アリルの検出方法(genotyping)については、「 [[シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定]]」を参照
+CRISPR-Cas9でゲノム編集した植物のシークエンスを解析し、変異を同定する方法についての解説。
 ==[1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合==