シロイヌナズナの遺伝子型の判定
提供: 鈴木研Wiki
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| − | ! 判定する<br>遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! | + | ! !! 判定する<br>遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング温度 !! 伸長時間 !! PCR後の<br>バンドの長さ !! 備考 |
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| − | | width="50pt" |'''drol1-1''' || width=" | + | | width="5pt" |'''[A]''' || width="50pt" |'''drol1-1''' || width="120pt" |・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || width="110pt" |(185 bp) || このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別 ※方法は下記参照<br> '''HindIII処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp''' |
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| − | | '''drol1-2''' || | + | | '''[B]''' || '''drol1-2''' ||・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || '''「WT」<br>185 bp<br><br>「T-DNA = drol1-2」<br>≒355 bp''' || プライマー3本混ぜて、「WT」「T-DNA =drol1-2」の判別を1回のPCRで判定 <br>※各々の増幅プライマーの組み合せ<br>・「WT」：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII <br>・「T-DNA =drol1-2」：At3g24730#143-F, LBb1.3 |
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| − | | '''drol1-2''' <br> | + | | '''[C]''' || '''drol1-2, drol1-1''' <br>※同時に判別する場合 ||・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>185 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || プライマー3本混ぜて、「genome,WT」「T-DNA」の判別を1回のPCRで判定 <br>・「genome,WT」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII <br>・「T-DNA」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, LBb1.3 |
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| + | | '''[D]''' || '''drol1-2''' <br>※old ver. 上記推奨||「genome,WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>371 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || 各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 <br>このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない | ||
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==== ＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞ ==== | ==== ＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞ ==== | ||
2022年1月14日 (金) 11:17時点における版
試薬
- 0.4M NaOH
- 0.1M Tris-HCl pH 6.8
DNA抽出 マルチビーズショッカー
- 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
- ビーズを一粒入れる
- 40 µlの0.4M NaOHを入れる
- 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
- 遠心(フラッシュ)
- 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
- よく混合し、遠心(フラッシュ)
- 上清を鋳型として用いる
PCR
反応液の組成
| 1サンプル | |
| ExTaq | 0.1 µl |
| 10×ExTaq Buffer | 2 µl |
| 2.5mM dNTP | 1.6 µl |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| プライマー | 終濃度0.2 µM |
| DNA | 1 µl |
| 滅菌水 | up to 20 µl |
| 合計 | 20 µl |
反応
- 95℃ 3分
- [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
- 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)
＜drol1変異体の判別方法＞
| 判定する 遺伝子型 |
プライマーの組み合せ | アニーリング温度 | 伸長時間 | PCR後の バンドの長さ |
備考 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| [A] | drol1-1 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII |
55℃ | 1 min でOK | (185 bp) | このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別 ※方法は下記参照 HindIII処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp |
| [B] | drol1-2 | ・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「WT」 185 bp 「T-DNA = drol1-2」 ≒355 bp |
プライマー3本混ぜて、「WT」「T-DNA =drol1-2」の判別を1回のPCRで判定 ※各々の増幅プライマーの組み合せ ・「WT」：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII ・「T-DNA =drol1-2」：At3g24730#143-F, LBb1.3 |
| [C] | drol1-2, drol1-1 ※同時に判別する場合 |
・At3g24730#143-F ・drol1-1_HindIII ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「genome,WT」 185 bp 「T-DNA」 ≒355 bp |
プライマー3本混ぜて、「genome,WT」「T-DNA」の判別を1回のPCRで判定 ・「genome,WT」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII ・「T-DNA」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, LBb1.3 |
| [D] | drol1-2 ※old ver. 上記推奨 |
「genome,WT」 ・At3g24730#143-F ・anti6_At3724730 「T-DNA」 ・At3g24730#143-F ・LBb1.3 |
55℃ | 2 min | 「genome,WT」 371 bp 「T-DNA」 ≒355 bp |
各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない |
＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞
| 1サンプル | |
| 滅菌水 | 11.2 µl |
| 10xM Buffer | 1.5 µl |
| Hind III | 0.3 µl |
| PCR産物（上記参照） | 2 µl |
| 合計 | 15 µl |
MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別
※Hind III処理後、(WT)185 bp (drol1-1)152 + 33 bp
＜各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位＞
