ムラシゲ・スクーグ培地の作製
提供: 鈴木研Wiki
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*抗生物質など、必要に応じていれるもの （オートクレーブ後に入れる） | *抗生物質など、必要に応じていれるもの （オートクレーブ後に入れる） | ||
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| − | | カナマイシン|| style="text-align:right;"|50 mg/ | + | | カナマイシン || 形質転換体の選抜|| style="text-align:right;"|50 mg/L || style="text-align:right;"| 50 mg/ml |
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| − | | ハイグロマイシン || style="text-align:right;"| 20 mg/ | + | | ハイグロマイシン || 形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など）|| style="text-align:right;"| 20 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml |
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| − | | ハイグロマイシン || style="text-align:right;"| | + | | ハイグロマイシン || 形質転換体の選抜（drol1） || style="text-align:right;"| 10 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml |
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| − | | セフォタックス || style="text-align:right;"| 100 mg/ | + | | セフォタックス || アグロバクテリウムの増殖抑制 || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| 100 mg/ml |
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| − | | ルシフェリン || style="text-align:right;"| | + | | ルシフェリン || ルシフェラーゼ活性の測定 || style="text-align:right;"| 10 μM || style="text-align:right;"| 5 mM |
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'''T1植物用の培地の組成''' | '''T1植物用の培地の組成''' | ||
| − | :* ハイグロマイシン選抜 | + | :* '''ハイグロマイシン選抜''' |
::「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき | ::「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき | ||
:::→ ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す | :::→ ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す | ||
| − | :* GFP,RFPでの選抜 | + | :* '''GFP,RFPでの選抜''' |
::「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき | ::「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき | ||
| − | :::→ | + | :::→ 種子のGFP,RFPの蛍光で形質転換体を選抜する |
=== 実験方法 === | === 実験方法 === | ||
2023年3月3日 (金) 15:50時点における版
シロイヌナズナの育成のための培地作り
組成
- オートクレーブするもの
| ストック濃度 | 終濃度 | |
|---|---|---|
| MS塩 | 2× | 1/2× |
| MES-KOH (pH 5.7) | 5 ％ | 0.05 ％ |
| B5-Vitamin | 1000× | 1× |
| Sucrose | 2 % | |
| Gellan Gum | 0.3 % |
Sucroseの濃度は実験によって異なるので、作製する前に確認する （Gellan Gumの代わりに、植物培地用Agarを使う場合もある）
- 2×MS塩：MS塩1袋（1L用）を500mlの水に溶かしたもの （※MS塩＝ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類）
- ※アルミ袋の中に残った粉末も残さず水に溶かす（袋内に残った分は共洗いして入れる）
- B5-Vitamin：1000×の溶液（1mlずつに分注してある。-20℃）を使う
- 抗生物質など、必要に応じていれるもの （オートクレーブ後に入れる）
| 用途 | 終濃度 | ストック濃度 | |
|---|---|---|---|
| カナマイシン | 形質転換体の選抜 | 50 mg/L | 50 mg/ml |
| ハイグロマイシン | 形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など） | 20 mg/L | 20 mg/ml |
| ハイグロマイシン | 形質転換体の選抜（drol1） | 10 mg/L | 20 mg/ml |
| セフォタックス | アグロバクテリウムの増殖抑制 | 100 mg/L | 100 mg/ml |
| ルシフェリン | ルシフェラーゼ活性の測定 | 10 μM | 5 mM |
T1植物用の培地の組成
- ハイグロマイシン選抜
- 「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき
- → ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す
- GFP,RFPでの選抜
- 「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき
- → 種子のGFP,RFPの蛍光で形質転換体を選抜する
実験方法
- 1. メスシリンダーに
- ２×MS塩
- ５％ MES-KOH (pH 5.7)
- Elix 水
- Sucrose
- 1000×B5-Vitamin (-20℃)
- 以上の5つを入れて、スターラーにかける
- 2. Sucroceが溶けたら1Lにメスアップする
- 3. メデュウムビンに
- 0.3％ Gellan Gum
- 2 の培地
- を入れ、メデュウムビンの蓋を少し緩め、オートクレーブ (121℃、15min)
ここからはクリーンベンチ内で操作すること
- 4. オートクレーブ後、スターラーで撹拌しながら冷まし、
- 必要に応じて、抗生物質など を加える。
- 5. 滅菌2号角シャーレに分注し、固まるまで放置。
- 固まったらビニール袋に入れ、培地の種類（Sucrose濃度、Gellun Gum/ Agar濃度、抗生物質は忘れずに書く）、作製日、作製者を書く
- ルシフェリン入りの培地はアルミホイルに包む
- 4℃で保管 (プレートは逆さにする＝蓋が下になるように保管）
