ムラシゲ・スクーグ培地の作製

シロイヌナズナの育成のための培地作り

組成

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(1) オートクレーブするもの

	ストック濃度	終濃度
MS塩	2×	1/2×
MES-KOH (pH 5.7)	5 ％	0.05 ％
B5-Vitamin	1000×	1×
Sucrose		2 %
Gellan Gum		0.3 %

Sucroseの濃度は実験によって異なるので、作製する前に確認する　　（Gellan Gumの代わりに、植物培地用Agarを使う場合もある）

• 2×MS塩：MS塩1袋（1L用）を500mlの水に溶かしたもの　　（※MS塩＝ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類）

※アルミ袋の中に残った粉末も残さず水に溶かす（袋内に残った分は共洗いして入れる）

• B5-Vitamin：1000×の溶液（1mlずつに分注してある。-20℃）を使う

(2) 抗生物質など、必要に応じていれるもの　（オートクレーブ後に入れる）　　※下の表は、2023年3月に更新

	用途	終濃度	ストック濃度
カナマイシン (Km)	形質転換体の選抜	50 mg/L	50 mg/ml
ハイグロマイシン (Hyg)	形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など）	20 mg/L	20 mg/ml
ハイグロマイシン (Hyg)	形質転換体の選抜（drol1）	10 mg/L	20 mg/ml
セフォタックス (Cef)	アグロバクテリウムの増殖抑制	100 mg/L	100 mg/ml
ルシフェリン	ルシフェラーゼ活性の測定	10 μM	5 mM

バスタ（グルホシネート）については、各種試薬の作製方法（覚え書き）を参照

• T1植物用の培地の組成

• ハイグロマイシン選抜

「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき

→ ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す

• GFP,RFPでの選抜

「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき

→ 種子のGFP,RFPの蛍光で形質転換体を選抜する

• 「Sucrose濃度」「抗生物質の濃度」「Gellun Gum/Agarの使い分け」の早見表　　　※下の表は、2023年3月に記載

	通常の培地	T1植物 (Hyg選抜)	T1植物 (Hyg選抜の後 / GFP,RFP選抜)	たてプレート
Sucrose	2 %	1 %	2 %	1 %
ハイグロマイシン (Hyg)	-	20 mg/L (drol1の時は、10 mg/L )	-	-
セフォタックス (Cef)	-	100 mg/L	100 mg/L	-
Gellun Gum	0.3 %	0.3 %	0.3 %	-
Agar	-	-	-	1.5 %

実験方法

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1.　メスシリンダーに

• ２×MS塩
• ５％ MES-KOH (pH 5.7)
• Elix 水
• Sucrose
• 1000×B5-Vitamin (-20℃)

以上の5つを入れて、スターラーにかける

2. Sucroceが溶けたら1Lにメスアップする

3. メデュウムビンに

• 0.3％ Gellan Gum
• 2 の培地

を入れ、メデュウムビンの蓋を少し緩め、オートクレーブ (121℃、15min)

ここからはクリーンベンチ内で操作すること

4. オートクレーブ後、スターラーで撹拌しながら冷まし、

必要に応じて、抗生物質など　を加える。

5. 滅菌2号角シャーレに分注し、固まるまで放置。

固まったらビニール袋に入れ、培地の種類（Sucrose濃度、Gellun Gum/ Agar濃度、抗生物質は忘れずに書く）、作製日、作製者を書く

ルシフェリン入りの培地はアルミホイルに包む

4℃で保管 (プレートは逆さにする＝蓋が下になるように保管）