シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定
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==[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて== | ==[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて== | ||
| − | * CRISPR- | + | * CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、'''PAM配列（NGG）の上流3-4塩基間が切断'''される |
* その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる | * その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる | ||
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::※ 変異が生じると制限酵素サイトが無くなるので、「制限酵素で切れる」「切れない」の違いで、変異体の判別が可能になる | ::※ 変異が生じると制限酵素サイトが無くなるので、「制限酵素で切れる」「切れない」の違いで、変異体の判別が可能になる | ||
| − | + | * sgRNAの配列と検出に用いた制限酵素の例、については上記 '''[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて''' の図を参照 | |
| − | * sgRNAの配列と検出に用いた制限酵素の例、については上記[2]の図を参照 | + | |
:* この例では、ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅した断片 (383bp) をHaeIII処理すると、以下の長さの断片になる | :* この例では、ゲノム編集した箇所をはさんだ領域をPCRで増幅した断片 (383bp) をHaeIII処理すると、以下の長さの断片になる | ||
::::（右図の電気泳動パターンを参照） | ::::（右図の電気泳動パターンを参照） | ||
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==[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）== | ==[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）== | ||
'''(1) キャピラリーシークエンスを行う''' | '''(1) キャピラリーシークエンスを行う''' | ||
| − | * '''[3]''' | + | * '''[3]変異型アリルの検出''' で用いたPCR産物（制限酵素処理"前"のもの）を用いて、シークエンス解析を行う |
* キャピラリーシークエンスの方法は、「[[BigDye Terminaterを使ったシークエンス]]」を参照 | * キャピラリーシークエンスの方法は、「[[BigDye Terminaterを使ったシークエンス]]」を参照 | ||
::* シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー | ::* シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー | ||
2021年11月12日 (金) 10:40時点における版
[1]（概要）CRISPR-Cas9によるゲノム編集での変異体の作製
＜CRISPR-Cas9によるゲノム編集の概要＞
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※ 右の図は、「ゲノム編集産業化ネットワーク」のサイトより引用
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＜ゲノム編集による変異体の作製手順：pKIベクターを用いた場合＞
以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html
- （※ ガイドRNAの設計方法については、別記参照)
[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて
- CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、PAM配列（NGG）の上流3-4塩基間が切断される
- その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる
- 以下は、ゲノム編集での変異アリルの例
- 挿入・欠失 (indel) は上記の例のように、数bpの場合もあれば、数十bp～100bp以上の場合もある
[3] 変異型アリルの検出（遺伝子型の同定：genotyping）
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[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）
(1) キャピラリーシークエンスを行う
- [3]変異型アリルの検出 で用いたPCR産物（制限酵素処理"前"のもの）を用いて、シークエンス解析を行う
- キャピラリーシークエンスの方法は、「BigDye Terminaterを使ったシークエンス」を参照
- シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー
- ＝PCR産物１個につき、シークエンスは２サンプル、となる （両側のプライマー＝センス、アンチセンスの２種類で読むため）
- 1反応 (計10ul) あたりに、PCR産物を "1ul" 使用する
- （プライマーダイマーがある場合は、精製・定量したうえで、プロトコール通りの量を使用 （精製方法：NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製）
(2) 解析に使うデータ（ファイル）を準備する
- キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1） ※上記(1)で得られたデータ
- ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）
(3) シークエンスデータを解読して配列を決定し、アリルを同定する
- シークエンスデータの解読方法については、別記「ゲノム編集した植物のシークエンスの解析」を参照
