シロイヌナズナのゲノム編集について：概要、変異アリルの検出・同定

[1]（概要）ゲノム編集で変異体を作成する手順：pKIベクターを用いた場合

• 以下の説明は、pKIベクターの解説サイトの図に一部加筆したもの　　https://www.jst.go.jp/pr/announce/20161117-2/index.html

（※ ガイドRNAの設計方法については、別記参照)

[2] ゲノム編集によってできる変異型のアリルについて

• CRISPR-Cas9によるゲノム編集では、PAM配列（NGG）の3塩基手前が切断される
• その切断個所を修復する際に、「挿入・欠失 (indel)」が生じて、フレームシフト等の変異型アリルができる

• 以下は、ゲノム編集での変異アリルの例

• 挿入・欠失 (indel) は上記の例のように、数bpの場合もあれば、数十bp～100bp以上の場合もある

[3] 変異型アリルの検出（遺伝子型の同定：genotyping）

ゲノム変種による変異の有無を検出できるように、制限酵素サイトの近傍にsgRNAを設計する　（変異が生じると制限酵素サイトが無くなる） sgRNAの配列と検出に用いた制限酵素の例、については上記[2]の図を参照 この例では、383bpのPCR産物をHaeIII処理すると、以下の長さの断片になる ・（野生型）制限酵素(HaeIII)で切れる　　->　272bp, 111bp の2本の断片 ・（変異型）制限酵素(HaeIII)で切れない　->　約383bp の断片 ※ 右図の電気泳動パターンでは、変異体Ａ：ホモの変異体、変異体Ｂ：長さの異なる2種類の変異型アリルをもつ（Bi-allelic） 遺伝子型の同定を行う際の「DNA抽出、PCR、制限酵素処理」の手順については、「シロイヌナズナの遺伝子型の判定」を参照

[4] 変異型アリルの同定（ゲノム編集した植物のシークエンス解析）

(1) キャピラリーシークエンスを行う

• [3]で用いたPCR産物（制限酵素処理"前"のもの）を用いて、シークエンス解析を行う
• キャピラリーシークエンスの方法は、「BigDye Terminaterを使ったシークエンス」を参照

• シークエンス反応時に使うプライマーは、[3]のPCRで使用した両側のプライマー

＝PCR産物１個につき、シークエンスは２サンプル、となる　（両側のプライマー＝センス、アンチセンスの２種類で読むため

• 1反応 (計10ul) あたりに、PCR産物を "1ul" 使用する　

（プライマーダイマーがある場合は、精製・定量したうえで、プロトコール通りの量を使用　（精製方法：NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを使ったDNA精製）

(2) 解析に使うデータ（ファイル）を準備する

• キャピラリーシークエンサーで読んだ波形ファイル（拡張子.ab1）　※上記(1)で得られたデータ
• ゲノム編集した「遺伝子のもとの配列」の情報（sgRNA配列の位置がわかるもの）

(3) シークエンスデータを解読して配列を決定し、アリルを同定する

• シークエンスデータの解読方法については、別記「ゲノム編集した植物のシークエンスの解析」を参照