ムラシゲ・スクーグ培地の作製

2024年1月19日 (金) 10:51時点における最新版

シロイヌナズナの育成のための培地作り

[編集] 組成

(1) オートクレーブするもの

	ストック濃度	終濃度
MS塩	2×	1/2×
MES-KOH (pH 5.7)	5 ％	0.05 ％
B5-Vitamin	1000×	1×
Sucrose		2 %
Gellan Gum		0.3 %

Sucroseの濃度は実験によって異なるので、作製する前に確認する　　（Gellan Gumの代わりに、植物培地用Agarを使う場合もある）

2×MS塩：MS塩1袋（1L用）を500mlの水に溶かしたもの　　（※MS塩＝ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類）

※アルミ袋の中に残った粉末も残さず水に溶かす（袋内に残った分は共洗いして入れる）

B5-Vitamin：1000×の溶液（1mlずつに分注してある。-20℃）を使う

(2) 抗生物質など、必要に応じていれるもの　（オートクレーブ後に入れる）　　※下の表は、2023年3月に更新

	用途	終濃度	ストック濃度
カナマイシン (Km)	形質転換体の選抜	50 mg/L	50 mg/ml
ハイグロマイシン (Hyg)	形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など）	20 mg/L	20 mg/ml
ハイグロマイシン (Hyg)	形質転換体の選抜（drol1）	10 mg/L	20 mg/ml
セフォタックス (Cef)	アグロバクテリウムの増殖抑制	100 mg/L	100 mg/ml
ルシフェリン	ルシフェラーゼ活性の測定	10 μM	5 mM

バスタ（グルホシネート）については、各種試薬の作製方法（覚え書き）を参照

T1植物用の培地の組成

ハイグロマイシン選抜

「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき

→ ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す

GFP,RFPでの選抜

「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき

→ 種子のGFP,RFPの蛍光で形質転換体を選抜する

「Sucrose濃度」「抗生物質の濃度」「Gellun Gum/Agarの使い分け」の早見表　　　※下の表は、2023年3月に記載

	通常の培地	T1植物 (Hyg選抜)	T1植物 (Hyg選抜の後 / GFP,RFP選抜)	たてプレート
Sucrose	2 %	1 %	2 %	1 %
ハイグロマイシン (Hyg)	-	20 mg/L (drol1の時は、10 mg/L )	-	-
セフォタックス (Cef)	-	100 mg/L	100 mg/L	-
Gellun Gum	0.3 %	0.3 %	0.3 %	-
Agar	-	-	-	1.5 %

[編集] 実験方法

1.　メスシリンダーに

２×MS塩
５％ MES-KOH (pH 5.7)
Elix 水
Sucrose
1000×B5-Vitamin (-20℃)

以上の5つを入れて、スターラーにかける

2. Sucroceが溶けたら1Lにメスアップする

3. メデュウムビンに

0.3％ Gellan Gum
2 の培地

を入れ、メデュウムビンの蓋を少し緩め、オートクレーブ (121℃、15min)

ここからはクリーンベンチ内で操作すること

4. オートクレーブ後、スターラーで撹拌しながら冷まし、

必要に応じて、抗生物質など　を加える。

5. 滅菌2号角シャーレに分注し、固まるまで放置。

固まったらビニール袋に入れ、培地の種類（Sucrose濃度、Gellun Gum/ Agar濃度、抗生物質は忘れずに書く）、作製日、作製者を書く

ルシフェリン入りの培地はアルミホイルに包む

4℃で保管 (プレートは逆さにする＝蓋が下になるように保管）

@@ 3行: / 3行: @@
 === 組成 ===
 ----
+'''(1) オートクレーブするもの'''
-* 1×MS塩 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　ストック　　    2×MS塩
+{| class="wikitable"
+|-
+!!! ストック濃度 !! 終濃度
+|-
+| MS塩|| style="text-align:right;"|2× || style="text-align:right;"| 1/2×
+|-
+| MES-KOH (pH 5.7) || style="text-align:right;"| 5 ％|| style="text-align:right;"| 0.05 ％
+|-
+| B5-Vitamin || style="text-align:right;"| 1000×|| style="text-align:right;"| 1×
+|-
+| <font color="red"><b>Sucrose</b></font> || style="text-align:right;"| || style="text-align:right;"| 2 %
+|-
+| <font color="red"><b>Gellan Gum</b></font> || style="text-align:right;"| || style="text-align:right;"| 0.3 %
+|}
-:: (ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類)
+<font color="red">Sucroseの濃度</font>は実験によって異なるので、作製する前に確認する　　（<font color="red">Gellan Gum</font>の代わりに、植物培地用Agarを使う場合もある）
-* 0.05％ MES-KOH　pH5.7　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 5% Mes-KOH pH5.7
+:* 2×MS塩：MS塩1袋（1L用）を500mlの水に溶かしたもの　　（※MS塩＝ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類）
+::※アルミ袋の中に残った粉末も残さず水に溶かす（袋内に残った分は共洗いして入れる）
+:* B5-Vitamin：1000×の溶液（1mlずつに分注してある。-20℃）を使う
-* 1×B5-Vitamin                                                      [[1000×B5-Vitamin/100ml]]
-* 1% Sucrose(スクロース)
+'''(2) 抗生物質など、必要に応じていれるもの　（オートクレーブ後に入れる）'''　　※下の表は、2023年3月に更新
+{| class="wikitable"
+|-
+!!! 用途 !! 終濃度 !! ストック濃度
+|-
+| カナマイシン (Km) || 形質転換体の選抜|| style="text-align:right;"|50 mg/L || style="text-align:right;"| 50 mg/ml
+|-
+| ハイグロマイシン ('''Hyg''') || 形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など）|| style="text-align:right;"| 20 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml
+|-
+| ハイグロマイシン ('''Hyg''') || 形質転換体の選抜（drol1） || style="text-align:right;"| 10 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml
+|-
+| セフォタックス ('''Cef''') || アグロバクテリウムの増殖抑制 || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| 100 mg/ml
+|-
+| ルシフェリン || ルシフェラーゼ活性の測定 || style="text-align:right;"| 10 μM  || style="text-align:right;"| 5 mM
+|}
+バスタ（グルホシネート）については、[[各種試薬の作製方法（覚え書き）]]を参照
-* 0.3% Gellan Gum
-* 10μM ルシフェリン
+*'''T1植物用の培地の組成'''
+::* '''ハイグロマイシン選抜'''
+:::「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき
+::::→ ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す
+::* '''GFP,RFPでの選抜'''
+:::「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき
+::::→ 種子のGFP,RFPの蛍光で形質転換体を選抜する
-*   2ml  (-20℃)
-* 滅菌2号角シャーレ  15枚  1ml  (-20℃)
+*'''「Sucrose濃度」「抗生物質の濃度」「Gellun Gum/Agarの使い分け」の早見表'''　　　※下の表は、2023年3月に記載
+{| class="wikitable"
+|-
+!!! 通常の培地 !! T1植物 (Hyg選抜) !! T1植物 (Hyg選抜の後 / GFP,RFP選抜)  !! たてプレート
+|-
+| Sucrose || style="text-align:right;"| 2 % || style="text-align:right;"| 1 % || style="text-align:right;"| 2 % || style="text-align:right;"| 1 %
+|-
+| ハイグロマイシン ('''Hyg''') || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| 20 mg/L (drol1の時は、10 mg/L ) || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| -
+|-
+| セフォタックス ('''Cef''') || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| -
+|-
+| Gellun Gum || style="text-align:right;"| 0.3 % || style="text-align:right;"| 0.3 % || style="text-align:right;"| 0.3 % || style="text-align:right;"| -
+|-
+| Agar || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| 1.5 %
+|}
 === 実験方法 ===
 ----
-: 1. 1Lポリビーカーに
+: 1.　メスシリンダーに
-::*脱イオン水   約800ml
+::* ２×MS塩
+::* ５％ MES-KOH (pH 5.7)
+::* Elix 水
+::* Sucrose
+::* 1000×B5-Vitamin (-20℃)
-::* MS Plant Salt Mixture(ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類)   4.6g(1袋)
+:: 以上の5つを入れて、スターラーにかける
-::* Sucrose(スクロース)   10g
+: 2. Sucroceが溶けたら1Lにメスアップする
-::* 1000×B5-Vitamin   1ml(-20℃)
+: 3. メデュウムビンに
-::* 0.5M MES-KOH   5ml(4℃)
+::* 0.3％ Gellan Gum
+::* 2 の培地
-:: 以上の5つを入れて、スターラーにかける。
+:: を入れ、メデュウムビンの蓋を少し緩め、オートクレーブ (121℃、15min)
-: 2. スターラーにかけながらpHメーターを使い、
-:: 1M KOH を少しずつ加えて、pHを5.7に合わせる。
-: 3. 1Lにメスアップし、
-::* Gellan Gum 3g
-:: を加え、アルミホイルでポリビーカーの蓋をしてオートクレーブ(121℃、15min)
 ''''' <span style="color:red">ここからはクリーンベンチ内で操作すること</span> '''''
 : 4. オートクレーブ後、スターラーで撹拌しながら冷まし、
-::* ルシフェリン 2ml(-20℃)
+:: 必要に応じて、抗生物質など　を加える。
-:: を加える。
+: 5. 滅菌2号角シャーレに分注し、固まるまで放置。
-: 5. 滅菌2号角シャーレ15枚に分注し、固まるまで放置。
+:: 固まったらビニール袋に入れ、培地の種類（Sucrose濃度、Gellun Gum/ Agar濃度、抗生物質は忘れずに書く）、作製日、作製者を書く
-:: 固まったらアルミホイルで包み、作製日、作製者を書き込んで
+:: ルシフェリン入りの培地はアルミホイルに包む
-:: クリーンベンチから取り出して保管。
+:: 4℃で保管 (プレートは逆さにする＝蓋が下になるように保管）

ムラシゲ・スクーグ培地の作製

2024年1月19日 (金) 10:51時点における最新版

[編集] 組成

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