ムラシゲ・スクーグ培地の作製
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!!! ストック濃度 !! 終濃度 | !!! ストック濃度 !! 終濃度 | ||
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| − | | MS塩|| style="text-align:right;"|2× || style="text-align:right;"| | + | | MS塩|| style="text-align:right;"|2× || style="text-align:right;"| 1/2× |
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| MES-KOH (pH 5.7) || style="text-align:right;"| 5 ％|| style="text-align:right;"| 0.05 ％ | | MES-KOH (pH 5.7) || style="text-align:right;"| 5 ％|| style="text-align:right;"| 0.05 ％ | ||
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| B5-Vitamin || style="text-align:right;"| 1000×|| style="text-align:right;"| 1× | | B5-Vitamin || style="text-align:right;"| 1000×|| style="text-align:right;"| 1× | ||
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| + | <font color="red">Sucroseの濃度</font>は実験によって異なるので、作製する前に確認する （<font color="red">Gellan Gum</font>の代わりに、植物培地用Agarを使う場合もある） | ||
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| + | :* 2×MS塩：MS塩1袋（1L用）を500mlの水に溶かしたもの （※MS塩＝ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類） | ||
| + | ::※アルミ袋の中に残った粉末も残さず水に溶かす（袋内に残った分は共洗いして入れる） | ||
| + | :* B5-Vitamin：1000×の溶液（1mlずつに分注してある。-20℃）を使う | ||
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| + | '''(2) 抗生物質など、必要に応じていれるもの （オートクレーブ後に入れる）''' ※下の表は、2023年3月に更新 | ||
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| + | !!! 用途 !! 終濃度 !! ストック濃度 | ||
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| + | | カナマイシン (Km) || 形質転換体の選抜|| style="text-align:right;"|50 mg/L || style="text-align:right;"| 50 mg/ml | ||
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| + | | ハイグロマイシン ('''Hyg''') || 形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など）|| style="text-align:right;"| 20 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml | ||
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| + | | ハイグロマイシン ('''Hyg''') || 形質転換体の選抜（drol1） || style="text-align:right;"| 10 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml | ||
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| + | | セフォタックス ('''Cef''') || アグロバクテリウムの増殖抑制 || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| 100 mg/ml | ||
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| − | | ルシフェリン || style="text-align:right;"| | + | | ルシフェリン || ルシフェラーゼ活性の測定 || style="text-align:right;"| 10 μM || style="text-align:right;"| 5 mM |
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| + | バスタ（グルホシネート）については、[[各種試薬の作製方法（覚え書き）]]を参照 | ||
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| − | : | + | *'''T1植物用の培地の組成''' |
| + | ::* '''ハイグロマイシン選抜''' | ||
| + | :::「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき | ||
| + | ::::→ ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す | ||
| + | ::* '''GFP,RFPでの選抜''' | ||
| + | :::「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき | ||
| + | ::::→ 種子のGFP,RFPの蛍光で形質転換体を選抜する | ||
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| + | *'''「Sucrose濃度」「抗生物質の濃度」「Gellun Gum/Agarの使い分け」の早見表''' ※下の表は、2023年3月に記載 | ||
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| + | !!! 通常の培地 !! T1植物 (Hyg選抜) !! T1植物 (Hyg選抜の後 / GFP,RFP選抜) !! たてプレート | ||
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| + | | Sucrose || style="text-align:right;"| 2 % || style="text-align:right;"| 1 % || style="text-align:right;"| 2 % || style="text-align:right;"| 1 % | ||
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| + | | ハイグロマイシン ('''Hyg''') || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| 20 mg/L (drol1の時は、10 mg/L ) || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| - | ||
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| + | | セフォタックス ('''Cef''') || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| - | ||
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| + | | Gellun Gum || style="text-align:right;"| 0.3 % || style="text-align:right;"| 0.3 % || style="text-align:right;"| 0.3 % || style="text-align:right;"| - | ||
| + | |- | ||
| + | | Agar || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| - || style="text-align:right;"| 1.5 % | ||
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=== 実験方法 === | === 実験方法 === | ||
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::* ２×MS塩 | ::* ２×MS塩 | ||
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::* ５％ MES-KOH (pH 5.7) | ::* ５％ MES-KOH (pH 5.7) | ||
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::* Elix 水 | ::* Elix 水 | ||
| − | + | ::* Sucrose | |
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| − | + | ||
::* 1000×B5-Vitamin (-20℃) | ::* 1000×B5-Vitamin (-20℃) | ||
:: 以上の5つを入れて、スターラーにかける | :: 以上の5つを入れて、スターラーにかける | ||
| − | |||
: 2. Sucroceが溶けたら1Lにメスアップする | : 2. Sucroceが溶けたら1Lにメスアップする | ||
| − | |||
: 3. メデュウムビンに | : 3. メデュウムビンに | ||
::* 0.3％ Gellan Gum | ::* 0.3％ Gellan Gum | ||
| − | + | ::* 2 の培地 | |
| − | ::* 2 | + | |
:: を入れ、メデュウムビンの蓋を少し緩め、オートクレーブ (121℃、15min) | :: を入れ、メデュウムビンの蓋を少し緩め、オートクレーブ (121℃、15min) | ||
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''''' <span style="color:red">ここからはクリーンベンチ内で操作すること</span> ''''' | ''''' <span style="color:red">ここからはクリーンベンチ内で操作すること</span> ''''' | ||
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: 4. オートクレーブ後、スターラーで撹拌しながら冷まし、 | : 4. オートクレーブ後、スターラーで撹拌しながら冷まし、 | ||
| − | :: | + | :: 必要に応じて、抗生物質など を加える。 |
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: 5. 滅菌2号角シャーレに分注し、固まるまで放置。 | : 5. 滅菌2号角シャーレに分注し、固まるまで放置。 | ||
| − | :: | + | :: 固まったらビニール袋に入れ、培地の種類（Sucrose濃度、Gellun Gum/ Agar濃度、抗生物質は忘れずに書く）、作製日、作製者を書く |
:: ルシフェリン入りの培地はアルミホイルに包む | :: ルシフェリン入りの培地はアルミホイルに包む | ||
| − | :: 4℃で保管 ( | + | :: 4℃で保管 (プレートは逆さにする＝蓋が下になるように保管） |
2024年1月19日 (金) 10:51時点における最新版
シロイヌナズナの育成のための培地作り
[編集] 組成
(1) オートクレーブするもの
| ストック濃度 | 終濃度 | |
|---|---|---|
| MS塩 | 2× | 1/2× |
| MES-KOH (pH 5.7) | 5 ％ | 0.05 ％ |
| B5-Vitamin | 1000× | 1× |
| Sucrose | 2 % | |
| Gellan Gum | 0.3 % |
Sucroseの濃度は実験によって異なるので、作製する前に確認する （Gellan Gumの代わりに、植物培地用Agarを使う場合もある）
- 2×MS塩：MS塩1袋（1L用）を500mlの水に溶かしたもの （※MS塩＝ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類）
- ※アルミ袋の中に残った粉末も残さず水に溶かす（袋内に残った分は共洗いして入れる）
- B5-Vitamin：1000×の溶液（1mlずつに分注してある。-20℃）を使う
(2) 抗生物質など、必要に応じていれるもの （オートクレーブ後に入れる） ※下の表は、2023年3月に更新
| 用途 | 終濃度 | ストック濃度 | |
|---|---|---|---|
| カナマイシン (Km) | 形質転換体の選抜 | 50 mg/L | 50 mg/ml |
| ハイグロマイシン (Hyg) | 形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など） | 20 mg/L | 20 mg/ml |
| ハイグロマイシン (Hyg) | 形質転換体の選抜（drol1） | 10 mg/L | 20 mg/ml |
| セフォタックス (Cef) | アグロバクテリウムの増殖抑制 | 100 mg/L | 100 mg/ml |
| ルシフェリン | ルシフェラーゼ活性の測定 | 10 μM | 5 mM |
バスタ（グルホシネート）については、各種試薬の作製方法（覚え書き）を参照
- T1植物用の培地の組成
- ハイグロマイシン選抜
- 「ハイグロマイシン：20 mg/L（drol1は10 mg/L）、セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき
- → ハイグロマイシン耐性植物を選抜し、「セフォタックス：100 mg/L」の培地に移す
- GFP,RFPでの選抜
- 「セフォタックス：100 mg/L」の培地を作製し、種まき
- → 種子のGFP,RFPの蛍光で形質転換体を選抜する
- 「Sucrose濃度」「抗生物質の濃度」「Gellun Gum/Agarの使い分け」の早見表 ※下の表は、2023年3月に記載
| 通常の培地 | T1植物 (Hyg選抜) | T1植物 (Hyg選抜の後 / GFP,RFP選抜) | たてプレート | |
|---|---|---|---|---|
| Sucrose | 2 % | 1 % | 2 % | 1 % |
| ハイグロマイシン (Hyg) | - | 20 mg/L (drol1の時は、10 mg/L ) | - | - |
| セフォタックス (Cef) | - | 100 mg/L | 100 mg/L | - |
| Gellun Gum | 0.3 % | 0.3 % | 0.3 % | - |
| Agar | - | - | - | 1.5 % |
[編集] 実験方法
- 1. メスシリンダーに
- ２×MS塩
- ５％ MES-KOH (pH 5.7)
- Elix 水
- Sucrose
- 1000×B5-Vitamin (-20℃)
- 以上の5つを入れて、スターラーにかける
- 2. Sucroceが溶けたら1Lにメスアップする
- 3. メデュウムビンに
- 0.3％ Gellan Gum
- 2 の培地
- を入れ、メデュウムビンの蓋を少し緩め、オートクレーブ (121℃、15min)
ここからはクリーンベンチ内で操作すること
- 4. オートクレーブ後、スターラーで撹拌しながら冷まし、
- 必要に応じて、抗生物質など を加える。
- 5. 滅菌2号角シャーレに分注し、固まるまで放置。
- 固まったらビニール袋に入れ、培地の種類（Sucrose濃度、Gellun Gum/ Agar濃度、抗生物質は忘れずに書く）、作製日、作製者を書く
- ルシフェリン入りの培地はアルミホイルに包む
- 4℃で保管 (プレートは逆さにする＝蓋が下になるように保管）
