各種試薬の作製方法（覚え書き）
提供: 鈴木研Wiki
(版間での差分)
| (1人の利用者による、間の17版が非表示) | |||
| 4行: | 4行: | ||
大腸菌等の形質転換時に使うSOC培地は、以下のもので代用 | 大腸菌等の形質転換時に使うSOC培地は、以下のもので代用 | ||
# 液体LB培地を作製 （LB broth：2g/100ml ＠200mlビーカー）→ オートクレーブ | # 液体LB培地を作製 （LB broth：2g/100ml ＠200mlビーカー）→ オートクレーブ | ||
| − | # (クリーンベンチにて) | + | # (クリーンベンチにて) 2M グルコース溶液（オートクレーブ済み） を1ml（1/100量）添加 ※終濃度:20mM |
# 1.5mlチューブに1mlずつ分注 （100本できる） | # 1.5mlチューブに1mlずつ分注 （100本できる） | ||
* 分注には、分注器＋コンビチップを使うと便利 | * 分注には、分注器＋コンビチップを使うと便利 | ||
| − | * 1. | + | * 1.5mlチューブ100本≒大コーヒー瓶1本分 → ユニパックG-4・1袋に回収 |
==== 種子滅菌液 ==== | ==== 種子滅菌液 ==== | ||
| − | + | （5%ブリーチ液）: 次亜塩素酸ナトリウム 5ml、10% Triton 200μl / 100ml | |
| + | |||
| + | |||
| + | ==== MES-KOH (5%, pH5.7) ==== | ||
| + | MES 10g / 200ml で作製 | ||
| + | # MES 10gを量り取って、適量の水（150ml程度）で溶解 | ||
| + | # MESが溶解したら、1M KOHでpH5.7に合わせる | ||
| + | # 200mlまでメスアップし、この段階で再びpHを調節する | ||
| + | * pH調整で添加する1M KOHは13～16ml程度と量が多いので、最初の溶解時には、この分を考慮する | ||
| + | * メスアップするとpHが変動する（下がる）ため、最終容量でのpH調整が必須。（この時は最初よりpHが変動しやすいので注意） | ||
| + | |||
| + | |||
| + | ==== 1000x B5ビタミン ==== | ||
| + | 以下の組成で作製。1.5mlチューブに1mlずつ分注して-20℃保存 （分注には、分注器を使用） | ||
| + | {| class='wikitable' | ||
| + | | || 100 ml || 40 ml | ||
| + | |- | ||
| + | | ニコチン酸 ||100 mg|| 40 mg | ||
| + | |- | ||
| + | | チアミンHCl || 1 g || 400 mg | ||
| + | |- | ||
| + | | ピリドキシンHCl || 100 mg || 40 mg | ||
| + | |- | ||
| + | | myo-イノシトール || 10 g || 4 g | ||
| + | |} | ||
| + | |||
| + | |||
| + | ==== バスタ（グルホシネート） ==== | ||
| + | 形質転換後の植物の選抜に使う抗生物質の一種 | ||
| + | |||
| + | {| class="wikitable" | ||
| + | |- | ||
| + | !!! グルホシネート濃度 !! 場所 !! 備考 | ||
| + | |- | ||
| + | | 原液 || 18.5% || 試薬棚に保存（50mlチューブに入っている）|| 名大生化からもらった | ||
| + | |- | ||
| + | |ストック溶液 || 1% || -20℃の抗生物質ケース。 || 原液を18.5倍希釈して、フィルター滅菌 | ||
| + | |} | ||
| + | * 培地には、ストック溶液を1/1000量入れる（グルホシネート終濃度：0.001%） | ||
| + | |||
| + | |||
| + | ==== 抗生物質・全般 ==== | ||
| + | [[ムラシゲ・スクーグ培地の作製]]を参照（以下は、そのページの抗生物質の欄だけ抜粋した表） | ||
| + | {| class="wikitable" | ||
| + | |- | ||
| + | !!! 用途 !! 終濃度 !! ストック濃度 | ||
| + | |- | ||
| + | | カナマイシン (Km) || 形質転換体の選抜|| style="text-align:right;"|50 mg/L || style="text-align:right;"| 50 mg/ml | ||
| + | |- | ||
| + | | ハイグロマイシン ('''Hyg''') || 形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など）|| style="text-align:right;"| 20 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml | ||
| + | |- | ||
| + | | ハイグロマイシン ('''Hyg''') || 形質転換体の選抜（drol1） || style="text-align:right;"| 10 mg/L || style="text-align:right;"| 20 mg/ml | ||
| + | |- | ||
| + | | セフォタックス ('''Cef''') || アグロバクテリウムの増殖抑制 || style="text-align:right;"| 100 mg/L || style="text-align:right;"| 100 mg/ml | ||
| + | |- | ||
| + | | ルシフェリン || ルシフェラーゼ活性の測定 || style="text-align:right;"| 10 μM || style="text-align:right;"| 5 mM | ||
| + | |} | ||
| + | * 上記の「ストック濃度」で水に溶解（5mlチューブ使用） | ||
| + | * （クリーンベンチ内で）フィルター滅菌（10mlシリンジ＋0.22umフィルター）⇒オートクレーブ済みの1.5mlチューブに分注 | ||
==== 50 x TAE ==== | ==== 50 x TAE ==== | ||
| + | ※現在は、50xTAEを購入しているのでこの方法では作製していないが、記録として記載 | ||
{| class='wikitable' | {| class='wikitable' | ||
|試薬||分量 | |試薬||分量 | ||
| 25行: | 84行: | ||
|} | |} | ||
以上のものを混ぜて、1Lにメスアップする。 | 以上のものを混ぜて、1Lにメスアップする。 | ||
| − | |||
2024年3月15日 (金) 09:27時点における最新版
目次 |
[編集] SOC培地 もどき （LB培地+20mMグルコース）
大腸菌等の形質転換時に使うSOC培地は、以下のもので代用
- 液体LB培地を作製 （LB broth：2g/100ml ＠200mlビーカー）→ オートクレーブ
- (クリーンベンチにて) 2M グルコース溶液（オートクレーブ済み） を1ml（1/100量）添加 ※終濃度:20mM
- 1.5mlチューブに1mlずつ分注 （100本できる）
- 分注には、分注器＋コンビチップを使うと便利
- 1.5mlチューブ100本≒大コーヒー瓶1本分 → ユニパックG-4・1袋に回収
[編集] 種子滅菌液
（5%ブリーチ液）: 次亜塩素酸ナトリウム 5ml、10% Triton 200μl / 100ml
[編集] MES-KOH (5%, pH5.7)
MES 10g / 200ml で作製
- MES 10gを量り取って、適量の水（150ml程度）で溶解
- MESが溶解したら、1M KOHでpH5.7に合わせる
- 200mlまでメスアップし、この段階で再びpHを調節する
- pH調整で添加する1M KOHは13～16ml程度と量が多いので、最初の溶解時には、この分を考慮する
- メスアップするとpHが変動する（下がる）ため、最終容量でのpH調整が必須。（この時は最初よりpHが変動しやすいので注意）
[編集] 1000x B5ビタミン
以下の組成で作製。1.5mlチューブに1mlずつ分注して-20℃保存 （分注には、分注器を使用）
| 100 ml | 40 ml | |
| ニコチン酸 | 100 mg | 40 mg |
| チアミンHCl | 1 g | 400 mg |
| ピリドキシンHCl | 100 mg | 40 mg |
| myo-イノシトール | 10 g | 4 g |
[編集] バスタ（グルホシネート）
形質転換後の植物の選抜に使う抗生物質の一種
| グルホシネート濃度 | 場所 | 備考 | |
|---|---|---|---|
| 原液 | 18.5% | 試薬棚に保存（50mlチューブに入っている） | 名大生化からもらった |
| ストック溶液 | 1% | -20℃の抗生物質ケース。 | 原液を18.5倍希釈して、フィルター滅菌 |
- 培地には、ストック溶液を1/1000量入れる（グルホシネート終濃度：0.001%）
[編集] 抗生物質・全般
ムラシゲ・スクーグ培地の作製を参照（以下は、そのページの抗生物質の欄だけ抜粋した表）
| 用途 | 終濃度 | ストック濃度 | |
|---|---|---|---|
| カナマイシン (Km) | 形質転換体の選抜 | 50 mg/L | 50 mg/ml |
| ハイグロマイシン (Hyg) | 形質転換体の選抜（drol1以外の野生型など） | 20 mg/L | 20 mg/ml |
| ハイグロマイシン (Hyg) | 形質転換体の選抜（drol1） | 10 mg/L | 20 mg/ml |
| セフォタックス (Cef) | アグロバクテリウムの増殖抑制 | 100 mg/L | 100 mg/ml |
| ルシフェリン | ルシフェラーゼ活性の測定 | 10 μM | 5 mM |
- 上記の「ストック濃度」で水に溶解（5mlチューブ使用）
- （クリーンベンチ内で）フィルター滅菌（10mlシリンジ＋0.22umフィルター）⇒オートクレーブ済みの1.5mlチューブに分注
[編集] 50 x TAE
※現在は、50xTAEを購入しているのでこの方法では作製していないが、記録として記載
| 試薬 | 分量 |
| Tris | 242 g |
| 酢酸 | 57.1 ml |
| EDTA・2Na | 18.6 g |
以上のものを混ぜて、1Lにメスアップする。
