シロイヌナズナの遺伝子型の判定

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(→‎＜drol1変異体の判別方法＞)
(→‎プライマーと制限酵素の組合せ)
 
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== 試薬 ==
+
2023年8月に改正。　改正前のページ　→　[[シロイヌナズナの遺伝子型の判定（2023年8月以前のver.）]]
 +
 
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== (1) DNA抽出 （マルチビーズショッカー） ==
 +
==== 試薬 ====
 
* 0.4M NaOH
 
* 0.4M NaOH
 
* 0.1M Tris-HCl pH 6.8
 
* 0.1M Tris-HCl pH 6.8
  
−
== DNA抽出 　マルチビーズショッカー==
+
==== 手順 ====
 
# 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
 
# 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
 
# ビーズを一粒入れる
 
# ビーズを一粒入れる
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# 上清を鋳型として用いる
 
# 上清を鋳型として用いる
  
−
== PCR ==
+
== (2) PCR ==
−
=== 反応液の組成 ===
+
<table border="0"><tr>
 +
 
 +
<td>
 +
==== MightyAmp Ver.3 の場合 ====
 
{| class='wikitable'
 
{| class='wikitable'
−
|||1サンプル
+
|+ '''反応液の組成'''
 +
! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
 
|-
 
|-
−
|ExTaq||style="text-align:right;"|0.1 µl
+
|MightyAmp Ver3||style="text-align:right;"| 0.4 µl ||
 
|-
 
|-
−
|10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"|2 µl
+
|2×MightyAmp buffer Ver3 ||style="text-align:right;"| 10 µl ||
 +
|-
 +
|プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
 
|-
 
|-
−
|2.5mM dNTP||style="text-align:right;"|1.6 µl
+
|プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度0.3 µM || 10µMの場合、0.6 µl
 
|-
 
|-
−
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
+
|DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
 
|-
 
|-
−
|プライマー||style="text-align:right;"|終濃度0.2 µM
+
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
 
|-
 
|-
−
|DNA||style="text-align:right;"|1 µl
+
|合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
 +
|}
 +
 
 +
'''反応'''
 +
* '''2step PCR'''
 +
#  98℃ 2分
 +
# [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
 +
# (→ 4℃ ∞)
 +
 
 +
 
 +
* '''3step PCR'''
 +
#  98℃ 2分
 +
# [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
 +
# (→ 4℃ ∞)
 +
 
 +
</td>
 +
 
 +
<td>
 +
 
 +
==== Ex Taq の場合 ====
 +
{| class='wikitable'
 +
|+ '''反応液の組成'''
 +
! 試薬 !! 1サンプル分の量 !! 備考
 +
|-
 +
|ExTaq||style="text-align:right;"| 0.1 µl ||
 +
|-
 +
|10×ExTaq Buffer||style="text-align:right;"| 2 µl ||
 +
|-
 +
|2.5mM dNTP||style="text-align:right;"| 1.6 µl ||
 +
|-
 +
|プライマー (Forward)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
 +
|-
 +
|プライマー (Reverse)||style="text-align:right;"| 終濃度 0.2 µM || 10µMの場合、0.4 µl
 +
|-
 +
|DNA||style="text-align:right;"| 1 µl ||
 
|-
 
|-
−
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl
+
|滅菌水||style="text-align:right;"| up to 20 µl ||
 
|-
 
|-
−
|合計||style="text-align:right;"|20 µl
+
|合計||style="text-align:right;"| 20 µl ||
 
|}
 
|}
  
−
=== 反応 ===
+
'''反応'''
 
#  95℃ 3分
 
#  95℃ 3分
 
# [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
 
# [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
 
#  72℃ 5分  (→ 4℃ ∞)
 
#  72℃ 5分  (→ 4℃ ∞)
  
 +
<br><br><br>
 +
<!-- <table>タグで2段組にすると上下中央揃いになるため、改行タグ<br>で位置合わせした -->
 +
</td>
  
−
==== ＜drol1変異体の判別方法＞ ====
+
</tr>
 +
</table>
  
−
{| class="wikitable"
+
== (3) 制限酵素処理 ==
 +
<table border="0">
 +
<tr>
 +
 
 +
<td>
 +
{| class='wikitable'
 +
|+ '''反応液の組成'''
 +
|||1サンプル
 
|-
 
|-
−
! 判定する<br>遺伝子型 !! プライマーの組み合せ !! アニーリング<br>温度 !! 伸長時間 !! バンドの長さ !! 備考
+
|滅菌水||style="text-align:right;"| 5.7 µl
 
|-
 
|-
−
| '''drol1-1''' || width="150pt" |・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII || 55℃ || 1 min でOK || (185 bp) || このPCR産物をさらに制限酵素 Hind III で切って判別  　※方法は下記参照<br> HindIII処理後、(WT)185 bp　 (drol1-1)152 + 33 bp
+
|10x Buffer||style="text-align:right;"|1 µl
−
 
+
 
|-
 
|-
−
| '''drol1-2''' ||「genome,WT」<br>・At3g24730#143-F <br>・anti6_At3724730 <br> 「T-DNA」 <br>・At3g24730#143-F <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>371 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || 各個体について、「genome,WT」「T-DNA」の2種類のPCRを行った結果を合わせて判断。 <br>このプライマーでは、プライマー3本（At3g24730#143-F, anti6_At3724730, LBb1.3）を混ぜたPCRでは判別できない
+
|制限酵素||style="text-align:right;"|0.3 µl
−
 
+
 
|-
 
|-
−
| '''drol1-2''' <br>※未確認||・At3g24730#143-F <br>・drol1-1_HindIII <br>・LBb1.3|| 55℃ || 2 min || 「genome,WT」<br>185 bp<br><br>「T-DNA」<br>≒355 bp || プライマー3本混ぜて、「genome,WT」「T-DNA」の判別を1回のPCRで判定 <br>・「genome,WT」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, drol1-1_HindIII <br>・「T-DNA」(プライマー組み合わせ)：At3g24730#143-F, LBb1.3
+
|PCR産物（上記参照）||style="text-align:right;"|3 µl
 
|-
 
|-
 +
|合計||style="text-align:right;"|10 µl
 
|}
 
|}
 +
</td>
  
−
==== ＜drol1-1変異体の判別（Hind III 処理）＞ ====
+
<td>
 +
'''反応'''
 +
<br> →　37℃で1～2時間反応
 +
</td>
  
−
{| class='wikitable'
+
</tr>
−
|||1サンプル
+
</table>
 +
 
 +
== (4) 解析 ==
 +
MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別
 +
 
 +
 
 +
== ＜ 各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位 ＞ ==
 +
<table border="0">
 +
<tr>
 +
 
 +
<td>
 +
[[ファイル:drol1_genotyping.png]]
 +
</td>
 +
 
 +
<td>
 +
*'''WT (DROL1)'''
 +
**PCR：プライマー(1)+(2)で増幅（185bp）
 +
**HindIII処理後（185bpのまま）
 +
 
 +
*'''drol1-1'''
 +
**PCRプライマー：(1)+(2)で増幅（185bp）
 +
**HindIII処理後（152+33bp）
 +
 
 +
*'''drol1-2'''
 +
**PCRプライマー：(1)+(3)で増幅（≒355bp）
 +
**HindIII処理後（≒355bpのまま）
 +
</td>
 +
 
 +
</tr>
 +
</table>
 +
 
 +
== ＜ drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー ＞ ==
 +
==== プライマーと制限酵素の組合せ ====
 +
{| class="wikitable" style="width:100%"
 +
! 変異体 !! 遺伝子名 !! PCRのプライマー !! プライマー配列 !! PCR断片長 !! 制限酵素 !! 制限酵素処理後の長さ
 
|-
 
|-
−
|滅菌水||style="text-align:right;"| 11.2 µl
+
! drol1-1 <br>
 +
| DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII|| TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT|| 185 bp|| HindIII|| (WT) 185 bp <br> (drol1-1) 152+33 bp
 
|-
 
|-
−
|10xM Buffer||style="text-align:right;"|1.5 µl
+
! drol1-2 <br>
 +
| DROL1|| At3g24730#143-F <br> drol1-1_dCAPS-HindIII <br> LBb1.3 || TGATATCACGTTGTTTCCTTCG <br> GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT <br> ATTTTGCCGATTTCGGAAC || (WT)185 bp <br> (drol1-2)≒355 bp|| - || -
 
|-
 
|-
−
|Hind III||style="text-align:right;"|0.3 µl
+
! sudl1-1 <br> #8-5
 +
| U5-40k|| m2g181F <br> m2g181R|| CAAGATACAATCACAGGTATGAGC <br> CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC|| 383 bp|| HaeIII|| (WT) 272+111 bp <br> (#8-5) 383 bp
 
|-
 
|-
−
|PCR産物（上記参照）||style="text-align:right;"|2 µl
+
! sudl2-1 <br> #47-1a
 +
| PRP6|| prp6_47-1aF <br> prp6_47-1aR|| GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA <br> CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT|| 135 bp|| HindIII|| (WT) 135 bp <br> (#47-1a) 102+33 bp
 
|-
 
|-
−
|合計||style="text-align:right;"|15 µl
+
! sudl2-2 <br> #45-4b
−
|}→　37℃で1～2時間反応
+
| PRP6|| prp6_45-4bR <br> prp6_45-4bF|| GGAGATGGCTTGCCATTTCTCGCCATGCTTAAGCT<br> GAACGTGCTGTTACCGTTGG|| 155 bp|| HindIII|| (WT) 155 bp <br> (#45-4b) 120+35 bp
−
<br> MultiNAで泳動し、バンドの長さを判別
+
|-
−
　※Hind III処理後、(WT)185 bp 　(drol1-1)152 + 33 bp
+
! sudl3-1 <br> #14-4
 +
| PRP8|| prp8_14-4F <br> prp8_14-4R|| CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC <br> AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG|| 161 bp|| PvuI|| (WT) 128+33 bp <br> (#14-4) 161 bp
 +
|-
 +
! sudl3-2 <br> #49-4a
 +
| PRP8|| prp8_49-4aF <br> prp8_49-4aR|| ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG <br> ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT|| 130 bp|| SacI|| (WT) 97+33 bp <br> (#49-4a) 130 bp
 +
|-
 +
! sudl3-3 <br> #51-2a
 +
| PRP8|| prp8_51-2aF <br> prp8_51-2aR|| ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA <br> CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG|| 131 bp|| DdeI|| (WT) 97+34 bp <br> (#51-2a) 131 bp
 +
|-
 +
! sudl4-1 <br> #40-2b
 +
| SmBb|| smbb_40-2bF <br> smbb_40-2bR|| GCTTCAGTTCATCAACTACAGG <br> CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT|| 148 bp|| HindIII|| (WT) 148 bp <br> (#40-2b) 113+35 bp
 +
|-
 +
! sudl4-2 <br> #43-2b
 +
| SmBb|| smbb_43-2bF <br> smbb_43-2bR|| TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG <br> TCCACCAACACCACGAACAGGAC|| 133 bp|| BamHI|| (WT) 133 bp <br> (#43-2b) 97+36 bp
 +
|-
 +
|}

2024年4月9日 (火) 15:00時点における最新版

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[編集] (1) DNA抽出 （マルチビーズショッカー）

[編集] 試薬

  • 0.4M NaOH
  • 0.1M Tris-HCl pH 6.8

[編集] 手順

  1. 葉を一枚切り取り、サンプル破砕用チューブに入れる
  2. ビーズを一粒入れる
  3. 40 µlの0.4M NaOHを入れる
  4. 2000rpmで5秒オン、2秒オフのサイクルを2回行う
  5. 遠心(フラッシュ)
  6. 200 µlの0.1M Tris-HClを加える
  7. よく混合し、遠心(フラッシュ)
  8. 上清を鋳型として用いる

[編集] (2) PCR

[編集] MightyAmp Ver.3 の場合

反応液の組成
試薬 1サンプル分の量 備考
MightyAmp Ver3 0.4 µl
2×MightyAmp buffer Ver3 10 µl
プライマー (Forward) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl
プライマー (Reverse) 終濃度0.3 µM 10µMの場合、0.6 µl
DNA 1 µl
滅菌水 up to 20 µl
合計 20 µl

反応

  • 2step PCR
  1. 98℃ 2分
  2. [98℃ 10秒、(アニーリング + 伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
  3. (→ 4℃ ∞)


  • 3step PCR
  1. 98℃ 2分
  2. [98℃ 10秒、(アニーリング)60℃ 15秒、(伸長反応)68℃ 1分] のサイクルを35回
  3. (→ 4℃ ∞)

[編集] Ex Taq の場合

反応液の組成
試薬 1サンプル分の量 備考
ExTaq 0.1 µl
10×ExTaq Buffer 2 µl
2.5mM dNTP 1.6 µl
プライマー (Forward) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl
プライマー (Reverse) 終濃度 0.2 µM 10µMの場合、0.4 µl
DNA 1 µl
滅菌水 up to 20 µl
合計 20 µl

反応

  1. 95℃ 3分
  2. [95℃ 45秒、(アニーリング)55℃ 45秒、(伸長反応)72℃ 2分] のサイクルを35回
  3. 72℃ 5分 (→ 4℃ ∞)




[編集] (3) 制限酵素処理

反応液の組成
1サンプル
滅菌水 5.7 µl
10x Buffer 1 µl
制限酵素 0.3 µl
PCR産物（上記参照） 3 µl
合計 10 µl

反応
→　37℃で1～2時間反応

[編集] (4) 解析

MultiNA（あるいは、アガロースゲル）で電気泳動し、バンドの長さを判別


[編集] ＜ 各drol1変異体の変異箇所とプライマーの結合部位 ＞

Drol1 genotyping.png

  • WT (DROL1)
    • PCR：プライマー(1)+(2)で増幅（185bp）
    • HindIII処理後（185bpのまま）
  • drol1-1
    • PCRプライマー：(1)+(2)で増幅（185bp）
    • HindIII処理後（152+33bp）
  • drol1-2
    • PCRプライマー：(1)+(3)で増幅（≒355bp）
    • HindIII処理後（≒355bpのまま）

[編集] ＜ drol1変異体と各sudl変異体の遺伝子マーカー ＞

[編集] プライマーと制限酵素の組合せ

変異体 遺伝子名 PCRのプライマー プライマー配列 PCR断片長 制限酵素 制限酵素処理後の長さ
drol1-1
DROL1 At3g24730#143-F
drol1-1_dCAPS-HindIII		 TGATATCACGTTGTTTCCTTCG
GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT		 185 bp HindIII (WT) 185 bp
(drol1-1) 152+33 bp
drol1-2
DROL1 At3g24730#143-F
drol1-1_dCAPS-HindIII
LBb1.3 		TGATATCACGTTGTTTCCTTCG
GAAATGCACCAACCCATTTAGTATGATCCGAAGCT
ATTTTGCCGATTTCGGAAC 		(WT)185 bp
(drol1-2)≒355 bp		 - -
sudl1-1
#8-5 		U5-40k m2g181F
m2g181R		 CAAGATACAATCACAGGTATGAGC
CACAGCTTTGAAATTCAGATCTCTC		 383 bp HaeIII (WT) 272+111 bp
(#8-5) 383 bp
sudl2-1
#47-1a 		PRP6 prp6_47-1aF
prp6_47-1aR		 GCTGAGGAGAAAAGGTACGATGAGA
CCTCTGATCAATAGACTCCCAGATGGCATCAAGCT		 135 bp HindIII (WT) 135 bp
(#47-1a) 102+33 bp
sudl2-2
#45-4b 		PRP6 prp6_45-4bR
prp6_45-4bF		 GGAGATGGCTTGCCATTTCTCGCCATGCTTAAGCT
GAACGTGCTGTTACCGTTGG		 155 bp HindIII (WT) 155 bp
(#45-4b) 120+35 bp
sudl3-1
#14-4 		PRP8 prp8_14-4F
prp8_14-4R		 CAACCCGCAGAAAAGCTACTGCAGTCCTCTCGATC
AGTGACTCTTTTGCATCTTGCTTG		 161 bp PvuI (WT) 128+33 bp
(#14-4) 161 bp
sudl3-2
#49-4a 		PRP8 prp8_49-4aF
prp8_49-4aR		 ATTCATACTTTATTAATTATAGACATTGAGCCACG
ATTCTTGGCGGACACATAGTCTGCAATATTGAGCT		 130 bp SacI (WT) 97+33 bp
(#49-4a) 130 bp
sudl3-3
#51-2a 		PRP8 prp8_51-2aF
prp8_51-2aR		 ACCTGAAAGATGGTCCGTATGTCACTCCAGACTAA
CTTTGTGTCATGTTTGTATGACAATGGAGGGAATG		 131 bp DdeI (WT) 97+34 bp
(#51-2a) 131 bp
sudl4-1
#40-2b 		SmBb smbb_40-2bF
smbb_40-2bR		 GCTTCAGTTCATCAACTACAGG
CTTCTTCCCTTTAGCTGGTGGTAGCTTACGAAGCT		 148 bp HindIII (WT) 148 bp
(#40-2b) 113+35 bp
sudl4-2
#43-2b 		SmBb smbb_43-2bF
smbb_43-2bR		 TCGTGCTAAAGCTGGCTCTGCAGCTGCTGTTGCGG
TCCACCAACACCACGAACAGGAC		 133 bp BamHI (WT) 133 bp
(#43-2b) 97+36 bp
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